Summary
여기, 우리는 세 차원 (3D) 문화, 생산 확장하고 immunolabel 출생 후의 hippocampal 신경 전구 세포 (NPCs)하는 방법에 대해 설명합니다. 다음, 하이브리드 시각화 기술을 사용, 우리는 immunolabelled cryosections의 디지털 이미지가 전체 차원 neurosphere에 걸쳐 immunopositive 세포의 공간적 위치를 재구성하고지도하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
신경 줄기 및 전구 세포에 영향을 미치는 3 차원 (3D) 지형의 중요성 (NPC) 표현형 널리 아직 공부 도전 인정받고 있습니다. 배아 또는 사후 나탈 머리에서하면 dissociated, 단일 NPCs는 neurospheres을 형성 중지 분아 따위에 의해 번식합니다. 이러한 문화 이내 딸 세포가 저절로 같은 세포외 환경에 노출 임에도 불구하고 확장의 과정을 통해 서로 다른 발달 lineages을 (뉴런, oligodendrocytes 및 astrocytes) 채택. 이 진행의 recapitulates이 단계의 대부분은 이후 나탈 두뇌에서 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 관찰하고 종종 통제 환경에서 기본적인 NPC의 생물학을 연구하는 데 사용됩니다. NPC의 운명에서 이러한 문화 이내 3D 지형 및 셀룰러 위치의 전체 영향을 평가하는 것은, 그러나, 어렵습니다. 대상 단백질을 집중하고 immunocytochemistry하여 NPC의 lineages를 확인하려면 자유 떠있 neurospheres은 기판에 도금 또는 순차적으로 sectioned해야합니다. 이 처리는 동일한 세포 permeabilization과 영역에 걸쳐 항체 접근을 보장하기 위해 필요합니다. 그 결과, cryosections 또는 3D Z - 스택의 공촛점 reconstructions의 2D epifluorescent 이미지는 별도의 물리적 또는 디지털 3D 조각 내의 세포의 위치에 대한 공간 정보를 제공할 수 있고 손상 영역에 휴대폰 위치를 시각화하지 않습니다. 여기 neurosphere 문화의 지형을 강조하고 전체 문화 전반에 걸쳐 단백질 표현의 공간적 분석을 허용하는, 우리는 고립을위한 프로토콜, 확장하고, 대상 단백질의 epifluorescent 또는 공촛점 면역에 적합한 사후 나탈 hippocampal neurospheres 일련 sectioning을 제시. Connexin29 (Cx29)을 예로 분석이다. 다음 그래픽 편집 및 3D 모델링의 하이브리드를 사용하는 것은 엄격하게 생물 학적 세부 사항을 유지하기 위해 적용되는 소프트웨어, 우리는 이러한 이미지의 3D 구조 위치를 다시 조립하고 디지털 전체 neurosphere 내에 표시된 세포를지도하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법론은 대상 단백질 및 전체 3D 문화 지형을 통해 세포의 세포 위치 시각화 및 분석을 가능하게하고 체외에서 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 세포 사이의 공간 관계의 상세한 분석을 용이하게합니다.
임보와 발렌 주 엘라 모두 동등하게 기여 공동 첫번째 작가로 간주되어야합니다.
Protocol
1. 신경 전구 세포의 분리
격리 프로토콜 동안 항상 감기 조직 및 솔루션을 유지하라!
- 전에 문화를 시작하려면 다음 주식 솔루션을 준비 :
- 분리 미디어 (26 MM NaHCO 3, 124 MM NaCl, 5 KCl MM 0.1 MM CaCl 2 * 2 시간 2 O, 3.2 MM MgCl 2 * 6H 2 O, 10 MM D - 글루코오스, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 신경 단백 분해 효소 (25 MG :. -20 ° C. 더블 소주 H 2 O, 살균 필터와 -20 ° C에서 저장 aliquots에서 세포 분리에 사용되는 효소의 재고 농도를 준비에서 스트렙토 마이신 무균 필터와 10-15 ML aliquots에 저장 . / ML), papain (10 MG / ML), DNAseI (10 MG / ML) 실험의 날, 다음과 같은 최종 농도에서 분리 미디어 15 ML에 효소를 추가 : 1 MG / ML 프로 테아제, 0.1mg /을 최종 효소 농도를 포함 ML papain, 0.1 MG / ML DNAse I.의 해부 솔루션은 해부 과정에서 얼음에 보관하실 수 있습니다.
- 유지 미디어 : Dulbecco의 수정 이글의 중간 F12 (DMEM/F12), 2 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 1X B27 보충. 최대 3 개월까지 4 보관 수 ° C 4 B27 보충 최대 한 달 않고 ° B27 보충제와 C.
- 성장 요인 : 0.1 μg / ML 인간 재조합 표피 성장 인자 (hEGF) 10 μg / ML의 재고 aliquots을 준비 DMEM/F12에서 fibroblast의 성장 인자 - 2 (FGF - 2) + 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA). -20 ° C.에 저장
- lethally C57BL / 6 마우스 새끼를 마취시키기 위해서, 생쥐는 출생 후의 일 0-3에 Euthansol와 intraperitoneally을 주입하고 있습니다.
- 26 MM NaHCO 3, 124 MM NaCl, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2 * 2 시간 2 O, 1.3 MM MgCl 2 * 6H 2 O : 조심스럽게 표준 절개 및 인공 뇌척수를 포함하는 60mm 요리에 저장 (ACSF의 두뇌를 제거 , 10 MM D - 글루코오스, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신). 7.3으로 산도 경우 50 ML aliquots에 필요한 살균 필터, -20 ° C.에 저장
- vibratome 척에 Krazy 접착제, 주동이의 측면까지 당신을 직면 등의 측면과 소뇌 및 접착제의 두뇌를 제거하여 면도날, 블록 머리를 사용합니다. Leica 마이크로 VT1000S vibratome이 프로토콜에서 사용됩니다.
- 위치 vibratome에 척하고 적절한 구획에 ACSF 얼음을 추가합니다.
- 500 μm의 컷의 조각은 8.5 3.5-4.5 및 주파수 사이의 속도를 사용하여 두께.
- ACSF를 포함하는 요리에 hippocampal 형성을 포함하는 슬라이스를 수집합니다.
- (ACSF 제외) (CA3 영역 곡선 ventrally 시작까지) stereomicroscope 사용 bregma -1.60 mm와 -2.40 mm 사이 hippocampi를 제거하고 새로운 건조 접시에 놓으십시오. Leica MZ6 해부 현미경이 프로토콜에서 사용됩니다.
- 모든 hippocampi가 수집되면, (단일 및 액화 외관을 얻을 때까지) 메스로 조직을 말하다.
- 신경 단백 분해 효소, papain, 그리고 DNAse I을 (솔루션 준비 단계 # 1 참조)가 포함된 2.5 ML 분리 미디어를 포함하는 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 원본 조직의 많은이있다면 참고 (예, 6 새끼에서) 그것은 최적의 효소를 유지하기 위해 2.5 ML 분리 미디어 2 튜브를 사용하는 것이 좋습니다 : 조직 비율. ° C 45-60 분 회전 37 알을 품다. Labnet ProBlot 6 하이브 리다이 제이션 오븐은 (만델 과학을 통해 구입한) 회전 설정 4 설정이 프로토콜에서 사용됩니다.
- 5 분 300 XG에 원심 분리기 : 무균 조직 문화 칼륨 인산 10 ML은 생리 버퍼 (137 MM NaCl, 2.7 KCl MM 10 MM 인산 버퍼, 산도 7.4 kPBS) 추가합니다. Eppendorf의 원심 분리기 (모델 5702)는이 프로토콜에서 사용됩니다.
- kPBS 5 ML에 뜨는 및 resuspend 펠렛 폐기하십시오.
- 파스퇴르 피펫을 통해 분쇄하여 조직을 떼어 놓다.
- 5 분 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 유지 보수 매체 3 ML에 Resuspend 세포, 60mm 비 점착 성의 요리 Trypan 블루와 플레이트의 세포를 사용하여 계산 세포가 2.5 X 10 5 세포의 밀도에 (코닝 초저 준수 바인딩 요리가이 프로토콜에 사용되는, 재료 참조) 유지 보수 매체 5 ML에 / 요리. 배양 접시는 초저 준수 요리 대신에 사용할 수 있지만 문화는 도금과 자발적인 차별을 방지하기 위해 체외에서 처음으로 6 일간 확장 (DIV) 동안 매일 오전과 오후에 도청 수 있어야합니다.
- 10 NG / 바로 도금 후 ML의 최종 농도 20 NG / ML 및 FGF - 2의 최종 농도 hEGF를 추가합니다. DIV 14 수거 일까지 확장 단계에서 이틀 추가 성장 요인을 추가합니다. (확대 neurospheres의 동영상 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.)
** 참고 : 미디어의 확장 단계의 DIV 약 10 노란색 될 수 있습니다. 이 문제가 발생하면, 다른 한 ML 마이를 추가ntenance 미디어. 미디어 다음 날 다시 노란색 경우, 유지 보수 미디어의 또 다른 한 ML을 추가 - 여러분의 확장 단계 동안 필요에 계속 이런식으로 - 올바른 최종 농도를 유지하기 위해 그에 따라 성장 요인의 볼륨을 조정해야합니다.
2. 시리얼 Cryosectioning
- 분야는 고정 시점에서 잘 분리되도록 고정을 부드럽게 사전 neurospheres을 누릅니다.
- 직접 문화 느린 흔들림 20 분 실온에서 3.7 %와 부화의 최종 농도 (RT)에 분자 학년 포름 알데히드를 추가합니다. 스토벌 벨리 댄서는 2.5 회전 속도로 설정이 프로토콜에서 사용됩니다.
- 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 neurospheres를 수집하고 5 분 300 XG에 스핀 다운.
- 10 ML의 인산 나트륨에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 삭제하시겠습니까 호수가 (154 MM NaCl, 10 MM 인산 버퍼 nPBS) 버퍼. kPBS에서 nPBS로 솔루션 사용에 변화를합니다.
- 5 분 300 XG에 스핀 다운.
- nPBS에 50-10 ML 20 % 자당 (W / V) 용액에 Resuspend.
- 문화 cryoprotect 최소 24 H 4 ° C에서 neurospheres 보관하십시오.
- 최적의 절삭 온도 (-10 월) 컴파 운드와 일회용 cryomold를 입력합니다.
- 부드럽게 접시에 neurospheres 들어있는 자당 솔루션을 부어.
- 기계 중단의 최소한의 증거와 함께 다양한 크기의 대표적인 분야를 찾을 stereomicroscope을 사용합니다. 처음으로이 절차를 수행하면 일부 문화가 고장이나 찢어진 수 있습니다. 형태는 훌륭하게 연습 유지됩니다.
- 부드럽게 1 ML 피펫 팁 (최소 제거 자당 포함 - 솔루션의 볼륨을 유지)에 각각 neurosphere을 기음과 OCT 화합물에 넣습니다. 나중에 구체를 찾을 수 있도록 금형에 대략적인 위치를 표시합니다.
- 일단 cryomold로 몇 가지 분야에 놓여있다, 10은 흰색까지 CO 2를 사용하여 샘플을 플래시 동결.
- 큐브에 분야의 위치를 마크하고 금형의 큐브를 팝
- 사전 냉장 집게를 사용하여 이전 OCT있는 척하는 보안 필터 종이로 큐브를 넣으십시오.
- 큐브 주위에 더 많은 OCT 화합물을 장소와 CO 2를 사용하여 구체를 포함하는 블록을 준수하는 고정. 또는 그라 이오 스탯에 척 (필터 종이) 여과지에 물총 OCT 화합물 및 OCT에 직접 장소 큐브를 넣으십시오. OCT는 흰색과 어려운 때까지 기다리십시오. Leica CM1900 그라 이오 스탯이 프로토콜에서 사용됩니다.
- OCT 화합물은 흰색이됩니다되면, 당신은 평형에 대한 온도 적어도 30 분 기다려 후, 절단 블록에 척을 배치할 수 있습니다.
- 직렬 10 μm의 섹션은 흔적을 밖으로 찾고 neurosphere 섹션에 대한 현미경 검사 자주 잘라. 한 슬라이드에 가능한 많은 섹션으로 배치합니다. 당신 neurosphere의 처음 몇 조각이 세포를 볼 때까지 현미경 있으므로 모든 섹션을 수집이 시작하기 전에 귀하의 분야의 끝에 3-5 섹션을 유지 볼 수 없을 수 있습니다. 이 앞쪽에와 후부 섹션도 immunocytochemistry에 대한 처리됩니다. 당신은 표준 거꾸로 위상 현미경 아래에서 즉시 명확하지 neurosphere 극지에서 단일 세포를 감지할 수로 immunostaining을 수행하는 핵 counterstain 따라서 핵심입니다.
- -20 ° C.에 저장 섹션
3. Immunocytochemistry
- 모든 섹션을 통해 부드럽게 nPBS을 적용하고 5 분 RT의 잠복기가 -20 ° C와 해동에서 슬라이드를 제거합니다.
- 초과 nPBS 조정관을 풀 즉시 AB 버퍼에 희석 기본 항체 (0.3 % nPBS에서 알부민 트리톤 X - 100, 0.3 % 소 혈청, 산도 7.2) 적용됩니다. 당신은 슬라이드 회 ~ 100 μL가 필요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 3D neurosphere 문화에있는 개별 NPC의 자손에 Cx29을 집중.
- parafilm와 커버는 섹션을 충당하기 위해하지만 parafilm은 슬라이드의 너비에 도달하거나 초과하면 항체가 삼투하여 슬라이드를 얻을 수 있으므로 현미경 슬라이드의 크기를 초과하지 했네요. parafilm는 증발을 방지할 수 있습니다. 습기 챔버 4 ° C에서 밤새 품어. 섹션을 통해 parafilm을 부동하는데주의를 기울여야하고 슬라이드에 맞게하는 것을 허용하지 않습니다. 그러나, 제거하거나 관심이 부분에 대한 전단 힘을 적용함으로써 형태를 방해하지 않도록해야합니다로 한번 적용 parafilm 배치를 변경하지 마십시오.
- 섹션에 직접 ~ 1 ML의 nPBS을 추가하고 parafilm을 떠. parafilm 멀리 수레 때까지 또는 코플린있는 항아리에 세로로 직접 슬라이드를 놓으십시오. 당신은 깨지기 쉬운 neurosphere 구조를 혼란 수도 있으므로 그것이 조작의 독립적으로 떨어져 수레 때까지 parafilm를 제거하지 마십시오. parafilm이 슬라이드 해제되면, RT에서 5 분 알을 품다. nPBS 조정관을 풀 5 분 RT 3 이상 씻는다를 계속합니다.
- 1 RT에서 AB 버퍼와 부화에 희석 차 항체를 적용위에서 설명한 것처럼 습기 챔버에 H. 다시 ~ 100 μL / 슬라이드 필요합니다.
- 4 단계에서 nPBS의 세척을 반복합니다. 5 분 3 차 세척 (Hoechst 33258 0.5 μg / nPBS의 ML)에 핵 counterstain을 적용하고 RT에서 5 분 최종 세척과 함께 진행합니다.
- 구석에 nailpolish 먼저 coverslip을 보장하며, 원하는 안티 퇴색 실장 미디어 coverslip에 마운트 후 모든 가장자리 주변 (글리세롤 기반 미디어를 사용하는 경우) 손실을 방지합니다.
- epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 컬렉션에 진행합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 Leica DMRA2, 하마 마츠 오르카 ER 카메라 및 OpenLab v3.56 소프트웨어를 사용합니다. 이 예제에서는 이미지를 세 채널에서 촬영된 있습니다 : (1) 페이즈 대비, (3) 블루 UV (Leica A4 큐브 : 필터 조합 예 40분의 360, 400 디, SP BP470/40), 그리고 레드 (Leica Y3 큐브 : 필터 조합 예 BP535/50, 디 565, SP 75분의 610). 단일 세포의 위상 탐지가 어려운 DNA의 Hoechst 33258 라벨을 사용하여 기둥을 추적하여 첫 번째와 마지막 부분에 가까운주의를 기울이고 각 시리얼 섹션을 쏴.
4. 정렬
- cryosections이 현미경 라인에 해동 장착하는 경우, 그들의 행동과 아주 약간 회전합니다. 이러한 편차가 수정되어야합니다. 또한, 각각의 시리얼 섹션 군데 때, 각 이미지의 중심은 화면의 같은 위치에되지 않을 수도 있습니다. 결과적으로, 각 디지털 시리얼 부분은 신중하게 정확한 형태를 유지하기 위해 이전 섹션 realigned해야합니다. 이 정렬은 cytoarchitecture 및 지형 세부 사항에주의하고 정확한주의가 필요합니다.
- 10 μm의와 50 μm의 (OpenLab v3.56 소프트웨어 설립)의 각 채널과 주민 스케일 바의 직렬 이미지는 개별 TIFF 파일로 저장되고 3300 X 2550 픽셀의 표준 캔버스 크기 72의 해상도를 사용하는 포토샵 CS4에 가져옵니다 픽셀 / 인치. 캔버스의 크기에 세심한주의가 정확한 규모를 유지하기 위해이 수입에 촬영해야합니다. 캔버스 크기와 해상도는 마야의 후속 모델로 열쇠입니다. 포토샵에서 별도의 레이어로 저장 규모 표시줄, XY 치수에 아무런 변화가 포토샵에서 정렬하는 동안 발생하지되었는지 확인하는 데 사용해야합니다.
- 다음, 같은 섹션 (즉, 각 섹션에 대한 각 단계, UV, 그리고 Cy3 이미지 시리즈 링크)에 해당하는 세 가지 (또는 이상) 레이어를 연결합니다. 이것은 하나의 레이어 정렬 때, 그 부분과 관련된 다른 레이어도 동시에 정렬하는 보장합니다. 또는 적절한 위치 (아래 참조)에서 한 단계 레이어를 잠금 다음 단계 계층에 해당 섹션의 관련 레이어를 정렬할 수 있습니다.
- 시작하려면 레이어 창에서 "눈"아이콘을 클릭하여 모든 레이어가 보이지합니다.
- 레이어 창에서 "눈"아이콘을 클릭하여 neurosphere 시리얼 섹션의 첫 번째와 두 번째 위상 콘트라스트 이미지를 돌립니다. 두 번째 섹션의 투명성을 높이십시오. '이미지'탭 아래 "이미지 회전"을 열고 선택 "임의의." 이 이미지 사이의 기하학 및 구조 접근 지점을 식별할 수있을 때까지 두 번째 섹션을 회전합니다. UV 채널 (Hoechst 33258 - 표시된 부분)를 앞뒤로 비교하는 것이 도움이 그것입니다.
- 모든 섹션 및 모든 채널이 정확하게 정렬되기 전까지는 "가장 가까운 이웃"(즉, 즉각적인 사후 섹션 바로 앞의 섹션) 비교 이후의 모든 시리얼 섹션에 대한 반복합니다.
- 포토샵 파일과 같은 비율입니다 마야 V10에서 비행기를 만듭니다.
5. 셀 예표론
- 마야의 사용자 인터페이스의 상태 라인에서, 기본 애니메이션 설정에서 표면에 메뉴 표시줄을 변경합니다.
- 셀 본체를 만드는 원시 디비전 영역을 사용합니다.
- neurosphere을 선택한 객체에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 표시 메뉴에서 꼭지점을 선택하여 그 정점을 조작 시작합니다. 또한 마킹 메뉴에서 표시 수준을 변경하여 구면의 표면을 정교.
- 메인 메뉴의 서브 디비전 표면 탭에서 축소 계층 옵션 상자를 열고 2 수준의 개수를 설정합니다. 영역을 축소합니다.
- 표면에서 다각형으로 메뉴 모음을 변경합니다.
- 영역을 선택한 상태에서 메인 메뉴의 메쉬 탭에서 조각 기하학 도구를 엽니다.
- 도구 설정 탭에서 조각 기하학 툴들을 채용 최종 형태로 세포의 표면을 수정하십시오.
- NPCs과 neurosphere에서 NPC의 자손의 현재의 다양한 시뮬레이션 다른 세포 기관을 만들이 과정을 반복하십시오. 이 예제에서는 10 개의 다른 세포 기관은 neurosphere의 기초를 형성합니다.
- 세포 예표론과 프리즈 변환을 선택합니다.
- 당신의 예표론의 세포가 설립과 함께 두 개의 표면 쉐이더는 표현을 모두 세포를 표현하기위한 것입니다관심 단백질 (우리의 예제에서는 Cx29 양성 세포)와 단백질은 결석 세포. 여기, Cx29 immunoreactivity있는 모든 세포는 Cx29 - 긍정적인 지정되어 있습니다. 이러한 분석은 쉐이더에 수정 가능하지만이 예제에서는 subcellular 지방화는 모델로하지 않습니다.
- 주 메뉴의 Windows> 렌더링 편집기 탭에서 Hypershade 창을 엽니다.
- 표면 재료 탭에서 램프 쉐이더를 선택합니다.
- 속성 편집기를 열고 쉐이더 색상, 백열, 주변 색상, 범프 맵, 그리고 반사 색상 속성을 설정합니다.
- 주위 색상 노드와 범프 매핑 노드에 2D 도형 질감에 Brownian 3D 텍스쳐를 할당합니다.
- 결과 쉐이더의 입력 및 출력 연결을 선택하고 선택된 네트워크를 내보낼 수 있습니다.
- 셀 예표론을 선택하고 내보내기 선택 옵션 상자를 엽니다.
- 선택 파일 형식 mayaAscii 및 취소는 이러한 입력 상자를 포함합니다. 수출 선택.
6. 셀 매핑
- 포토샵 CS4에서 정렬된 시리얼 섹션 파일을 엽니다.
- 직렬 섹션의 각 전구 세포의 위치를 표시하는 연필 스트로크의 핵심을 설정합니다. 이 예제에서는 세 스트로크의 핵심 - 견고한 사각형, 점선이있는 사각형, 그리고 십자가와 광장 - 세포가 하나, 둘, 또는 세 부분에 위치하고 있는지 여부를 표시하는 데 사용됩니다. 스트로크의이 키는 더 이상 색깔에 의해 정의되고 있습니다 -이 예제에서는 빨강, 관심, Cx29 우리의 단백질을 표현하는 세포를 대표하고, 흰색은 Cx29을 표현하지 세포를 나타냅니다.
- 에 단계 레이어를 켜고 하얀 연필 스트로크 각 전구 세포의 중심을 표시 시작합니다. 당신의지도를 구축하는 데 섹션 폴더 내에 별도의 레이어를 사용합니다.
- 하나 이상의 섹션에 세포가 제대로 표시된 것을 보증하는 세포의 위치를 찾습니다 섹션 사이를 전환할.
- Cx29 레이어가 활성화된 상태로, Cx29이 긍정적으로 표현되는 지역에서 가을 셀을 선택합니다.
- 포토샵의 주 메뉴 막대의 편집 탭에서 채우기 명령을 선택하고 빨간색 흰색 스트로크를 변경합니다.
- 지도 완료와 함께, 마야 프로젝트의 sourceimages 폴더에 별도의 JPEG 이미지로 각 섹션을 저장합니다. 이렇게하려면, 새로운 마야 프로젝트를 먼저 생성해야합니다.
7. 3D로지도를 가져오기 및 조립
- 마야의 사용자 인터페이스의 상태 라인에서, 기본 애니메이션 설정에서 다각형으로 메뉴 모음을 변경합니다.
- 프로젝트 장면 폴더에서 planes.mb 및 scaleBar.mb 파일을 가져옵니다.
- 비행기가 선택한 객체에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 할당 신소재 탭을 열어 램버트 셰이더를 할당합니다.
- 속성 편집기에서 물질 색상 속성의 오른쪽에있는 바둑판 무늬 상자를 클릭하십시오.
- 팝업 메뉴에서 2D 질감 섹션에서 파일을 선택합니다.
- 속성 편집기에서 그 이상의 파일 특성 섹션에서 이미지 이름 속성의 오른쪽에있는 파일의 아이콘을 클릭하십시오.
- sourceimages 폴더에서 첫 번째 섹션을 선택합니다.
- 패널 탭을 열어 관점보기에서 기본 정향 진화의 톱 볼 수있는 작업 영역 윈도우의 카메라를 전환합니다.
- 메인 메뉴의 메쉬 탭에서 만들기 다각형 도구를 선택하고 섹션의 윤곽을 추적.
- sourceimages 폴더에서 첫 번째지도를 선택하고 다각형의 비행기를 만들 설립 단계에 따라 새로 만든 다각형 비행기에 할당합니다.
- 개체가 선택된 상태에서 비행기를 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 표시 메뉴에서 UV를 선택합니다.
- 모든 비행기의 UV 포인트를 선택하고 주 메뉴의 Windows 탭에서 UV 텍스처 편집기를 엽니다.
- 섹션 비행기에 맞게 비례 자외선의 크기를 조정.
- 각 부분 사이의 공간 규모 표시줄의 높이에 해당 있도록 neurosphere의 각 섹션에 대해이 과정을 반복합니다.
8. 3D의 전구 세포의 Typologies 찾기
- 마야의 사용자 인터페이스의 상태 라인에서, 기본 애니메이션 역학에 설정 메뉴에서 도구 모음을 변경합니다.
- 보이는 neurosphere의 첫 번째 섹션을 떠나, 메인 메뉴의 디스플레이 탭에서 디스플레이 설정을 변경하여 다른 모든 부분을 숨길 수 있습니다.
- CV 커브 도구의 옵션 상자를 열고, 1을 선택 CV 커브 설정에서 선형.
- 톱 뷰 카메라에서 장면을보기 한 Cx29 - 부정적인 세포에 대한 곡선과 Cx29 양성 세포를 만드는 세포지도에 포인트를 지정 시작합니다.
- 사이드 뷰 카메라에서 볼 때 결과 곡선은 평평하고 있습니다. 가이드로 현미경 이미지에서 가져온 규모 막대를 사용하여 Y 축에있는 곡선의 점을 이동하여 섹션의 두께를 설정합니다.
- neurosphere의 각 구역에 대해이 과정을 반복합니다.
- 프로젝트의 장면 폴더에서 cellTyoplogy.ma 파일을 가져오기 및 neurosphere 내에서 Cx29 - 부정과 Cx29 - 긍정적인 세포 모두 세포 예표론 중복.
- 주 메뉴의 Windows> 렌더링 편집기 탭에서 Hypershade 창을 엽니다.
- 예표론의 세포로 지정 이전에 지어진 쉐이더를 가져옵니다.
- Outliner 창에서, 가져온 개체의 시작 부분에서 파일 이름을 제거합니다. 이것은 모델링 과정의 나중 단계에서 중요한 될 것입니다.
- 주 메뉴에서 입자 탭을 선택하고 최초의 CV 곡선의 입자 방출을 만듭니다.
- particleShape1 탭을 열고 배출 특성에 따라 -1에서 첫 번째 곡선에 점의 개수에 대한 최대 개수를 변경합니다.
- 렌더링에 탭이 Blobby 표면 (S / W)로 입자 렌더링 형식을 변경할 속성. 아래의 현재 렌더링 형식 상자를 클릭하고 입자 0.010의 반지름을 변경합니다.
- 처음엔 곡선을 선택 전환 입자를 선택하여 곡선의 정점에 입자를 부착합니다. 메인 메뉴의 입자 탭 내에서 목표 옵션을 열고 1 목표 체중을 설정합니다. 만들기를 누릅니다.
- Outliner 윈도우의 순서로 숫자 1에서 10 세포를 선택하고 메인 메뉴의 입자 탭에서 옵션 상자 Instancer (교환)을 엽니다. 인스턴스 개체 상자에서 10 개의 전지가 순서대로 나열되어야합니다.
- 인스턴스 탭을 입자 개체의 드롭 다운 목록에서 올바른 particleShape 이름을 선택하십시오. 만들기를 누릅니다.
- 기본적으로 선택된 첫 번째 휴대폰이 곡선을 따라 입자를 대체하게됩니다. 10 개의 종류의 입자 사이에 무작위로 나타납니다 사이클에 도착하기 위해서는 표현이 필요합니다. 두 번째 표현식은 세포가 동일한 방법으로 임의로 범위 슬라이더 높이기 때마다 배출되도록합니다.
- 에미터을 선택한 상태에서 속성 편집기를 엽니다. particleShape 탭에서 추가, 동적 속성 아래의 일반 상자를 클릭합니다. 긴 이름에서 random_index를 써주세요. 스칼라에서 당 입자 (배열)와 칠 속성 유형 스위치에 추가합니다.
- 당 입자 (배열) 탭을 속성에서 random_index 상자가 추가되었습니다. 빈 공간 위에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면, 표현식 작성을 선택합니다 ... 드롭 다운 메뉴에서.
- 표현의 텍스트를 입력합니다 상자 - particleShape1.random_index = RAND (10); 경우 (particleShape1.particleId == 1) 씨앗 (1);
- 표현의 속성 편집기에서 드롭 다운 목록에서 일반 옵션> 개체 인덱스 선택 random_index에 Instancer (기하학 교체) 탭을 열려 완료하려면. 첫 번째 프레임에 시간 슬라이더를 가지고 놀이에 충돌, 세포 유형은 지금 무작위로 입자 사이에 배포됩니다.
- neurosphere의 각 구역에 대해이 과정을 반복합니다. 각각의 새로운 에미터, instancer하고, 임의의 인덱스가 이름으로 차별과 Outliner 윈도우에서 적절하게 구성되어 있는지 확인하십시오.
9. 렌더링 / 합성
- 렌더 설정 창의 섹션을 사용하여 렌더링에서 정신 레이 마야 소프트웨어에서 렌더 러를 변경하십시오.
- 품질 탭을 열고 Raytracing 아래에서 제로로 설정 반사를 변경합니다. 프레임 버퍼 탭을 열고 알파로 원료의 선택을 취소 Premultiply에서 Colorclip을 변경합니다.
- 채널 박스 / 레이어 편집기를 열고 렌더링하는 디스플레이에서 레이어 편집기 설정을 변경할 수 있습니다.
- 예표론의 수입 셀을 선택하고 새 레이어를 만들고 할당 선택된 객체 아이콘을 클릭하십시오.
- 레이어 주위의 폐색의 이름을 바꿉니다.
- 새로 만든 레이어 위에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭, 메뉴에서 속성을 선택합니다.
- renderLayer 상자의 오른쪽에있는 프리셋 버튼을 클릭하고 드롭 다운 목록에서 폐색을 선택합니다.
- mib_amb_occlusion1 탭을 선택하고 16 일부터 256 샘플을 변경합니다.
- 채널 박스 / 레이어 편집기를 열고 옵션 탭에서 모든 레이어 옵션 상자 렌더링을 엽니다.
- 컴포지트 선택하고 레이어를 유지.
- 선택한 ambientOcclusion 계층과 함께 그냥 레이어 목록 위의 드롭 다운 메뉴에서 곱하기로 정상에서 변경합니다.
- 한번 masterLayer가 활성화된 상태로 한번 켜져 있고 ambientOcclusion 계층과 neurosphere 두 패스를 렌더링합니다. 프로젝트 이미지 폴더에 IFF 파일과 이미지를 저장합니다.
- 포토샵 CS4에서 두 이미지를 엽니다. masterLayer 위에 ambientOcclusion 레이어를 삽입하고 곱하면 그것을 설정합니다. 배경을 만들고 이미지를 평평하게.
Discussion
이 프로토콜은 문화와 순차적으로 cryosection 이후 나탈 hippocampal NPCs에게 절차를 설명하는 것은 면역에 의해 단백질 표현을 집중하고, 마지막으로 전체 3D neurosphere 이내 immunopositive 세포의 지형 위치를 재구성하고 분석합니다. 세포 생물학 문화와 가공 기술, 현미경 이미징을 (OpenLab, 순발력 및 기타 이미지 분석 소프트웨어) 결합하여, 그래픽 편집 소프트웨어 용량 (어도비 포토샵) 및 3D 애니메이션 및 합성 소프트웨어 용량 (오토 데스크 마야)는, 우리는 재구 성할 수있는 방법론을 제시 neurosphere 문화 전반에 걸쳐 휴대폰 위치와 단백질 표현의 충실 재건에 대한 수 있도록 일련 2D 이미지에서 3D 문화의 모든 세포 구성. 이 프로토콜은 등록과 두꺼운 시리얼 섹션을 통해 epifluorescent 얇은 시리얼 섹션 또는 공촛점 Z - 스택의 재건과 동일 효과와 함께하실 수 있습니다. 포스트 나탈 머리에 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 관찰 단계의 많은 neurosphere 문화 recapitulates 단일 NPCs의 clonal 확장 때문에, 그 3 차원 구조의 영향은 동일한 실험 환경 1 노출 자손에 중요한 NPC 운명의 결정자를 나타냅니다. 시리얼 neurosphere 섹션의 핵심과 주변에서 혈통과 단백질 표현의 발산은 세포 위치, 기계적 응력과 전단 강제를 포함하여 여러 물리적인 요소가 NPC 생물학 2 조절에서 중요한 역할을 제안합니다. 또한, connexin 단백질 표현, 여기에 분석은 NPCs가 3D 정지 neurospheres 또는 세포 플라스틱 기판이나 3D 무료 양식 여부 변경 기능 connexin - 중재 통신 laminin 기판에 도금으로 양식하는 경우에 따라 변경 표시되었습니다 - 부동 문화 3. NPC의 운명에 대한 세포 위치의 영향은 불분명 남아 있습니다. 그것은 기술적으로 혈통 및 신호 단백질의 antigenic 평가는 3D 건축의 중단은 세포 permeabilization 모든 세포에 항체 액세스를 활성화하는 데 필요한 특정 NPC 생물학에 3D 문화 이내 공간적 위치의 영향을 분석하는 도전이다. 여기, 우리가 하이브리드 시각화 방법론 특정 단백질이 3D 문화의 독특한 위치 localizations 전시 여부를 결정하는 수단을 제공한다는 것을 보여주기, 가장 중요한 아마도 neurosphere 이내 지역 현지화 관련하여 단백질 기능과 규제를 추론하고 테스트하는 데 사용하고, 수 , 3D 문화의 NPC 운명에 3D 지형 및 셀룰러 위치의 영향을 연구하는 데 필요한 위치 데이터를 제공합니다.
Disclosures
동물의 모든 실험은 오타와 애니멀 케어위원회의 대학과 동물 케어의 캐나다 협의회가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
우리는 비디오 제작 및 편집, 데이터 수집에 도움 매트 쿡의 전문 기술 지원 에반 다이사트 및 마크 레너드를 감사하고, 전문 편집 지원 사라 Gelbard. 작품은 SALB, SALB 및 SF에 건강 연구 프로그램 부여에서 전략적 교육 이니셔티브 (TGF Neurodegenerative Lipidomics에서 CIHR 교육 프로그램, 9121), 그리고 인프라 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR, 청소 62,626)에서 운영 기금에 의해 투자되었다 캐나다 온타리오 재단 혁신과 혁신 트러스트에서 SF로 지원합니다. SI는 파킨슨 연구 컨소시엄의 공헌과 과학 기술의 온타리오 대학원 장학금을 받았다. NV는 노화와 이후 전문적인 교제 Neurodegenerative Lipidomics에서 CIHR 교육 프로그램의 연구소를받습니다. 우리는 기꺼이 오토 데스크 리서치에서 제공하는 교육 소프트웨어 및 기술 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthansol | Reagent | Merck & Co. | ||
| Krazy Glue | Reagent | Home Hardware | ||
| VT1000S vibratome | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Neural protease | Reagent | Sigma-Aldrich | P6141 | Stock solutions stored at -20°C |
| Papain | Reagent | Sigma-Aldrich | P4762 | Stock solutions stored at -20°C |
| DNAse I | Reagent | Roche Group | 11 284 932 001 | Stock solutions stored at -20°C |
| MZ6 Dissecting Microscope | Equipment | Leica Microsystems | ||
| ProBlot 6 Hybridization Oven | Equipment | Labnet International | ||
| Centrifuge 5702 | Equipment | Eppendorf | ||
| kPBS | Reagent | BioShop Canada | PBS404 | |
| B27 Supplement | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes | Disposable | Corning | 3261 | |
| Human Epidermal growth Factor | Reagent | Invitrogen | 13247-051 | Stock solutions stored at -20°C |
| Fibroblast growth factor-2 | Reagent | Invitrogen | 13256-029 | Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C |
| 37% formaldehyde (molecular grade) | Reagent | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Belly Dancer Shaker | Equipment | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | ||
| Tissue- Tek Cryomold | Disposable | Sakura Finetek | 4566 | |
| Tissue-Tek OCT compound | Reagent | Sakura Finetek | 4583 | |
| Whatman Grade 703 Blotting Paper | Disposable | VWR international | 28298-020 | |
| CM1900 Cryostat | Equipment | Leica Microsystems | ||
| Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody | Reagent | Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
| H–chst 33258 | Reagent | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56 | Equipment/ Software | Leica Microsystems | This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope. | |
| Photoshop CS4 | Software | Adobe | Graphic software | |
| Maya v10 | Software | Autodesk | Modeling software | |
| Computer | Equipment | Intel | Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM) |
|
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen. |
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References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
- Campos, L. S. Neurospheres: insights into neural stem cell biology. J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).
- Imbeault, S. The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells. BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).
