Summary
Это видео демонстрирует процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов с использованием стандартных технологий целом клетки. Она включает в себя образы GFP меченых клеток и нейронов рассматриваться во время записи.
Abstract
В этом видео мы продемонстрируем процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов. Мы начнем с описания рассекает решение и захвата взрослые самки, используемые в наших исследованиях. Процедура снятия весь мозг неповрежденным, в том числе и оптических долях, проиллюстрировано. Препарирование вышележащих трахеи также показано на рисунке. Изолированных мозг не только малой, но нуждается в особом уходе в обработке на данном этапе, чтобы предотвратить повреждение нейронов, многие из которых близки к внешней поверхности ткани. Мы покажем, как специальный держатель мы разработали для стабилизации мозга в записи камеры. Стандартный электрофизиологии создали используется для записи с отдельных нейронов или пары нейронов. Флуоресцентные изображения, рассматривается через микроскоп записи, от GAL4 линии вождения GFP выражение (GH146) показывает, как проекционных нейронов (PNS) отмечены в живой мозг. Высокая мощность Номарского изображение показывает зрения одного нейрона, которые преследуют за весь записи клетки. Когда мозг успешно удален без повреждения, большинство нейронов спонтанно активных, выпустив потенциалов действия и / или экспонирование спонтанных синаптических входа. Это, в месте подготовки, в котором все записи ячейки определили нейронов в мозг целиком могут быть объединены с генетических и фармакологических манипуляций, является полезной моделью для изучения клеточной физиологии и пластичность во взрослой ЦНС.
Protocol
I. Препарирование мозга от взрослых летать
- Нанесите небольшое снижение (~ 100 мкл) рассекает решение в центре 35 мм чашки Петри.
- Поймать взрослую самку использовании аспиратора. Под микроскопом рассекает, используйте две иглы шприца обезглавить летать.
- Место голову в небольшую каплю рассекает физиологического раствора (папаин с нами) в чашке Петри.
- Позиция головы с хоботком перед нижней части блюда.
- Держите кутикулы покрытие левого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, просто медиальнее иглы 1.
- Держите ротовые с иглой 1 и использования иглы 2, чтобы сделать горизонтальный разрез, который простирается от брюшной поверхности левым глазом в правый глаз, на уровне основания хоботка.
- Держите кутикулы покрытие правого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, только медиальной иглы 1.
- Повернуть голову так, чтобы ростральной сторона лежит на поверхности чашки Петри. Вставьте иглу 1 между ростральной кутикулы и головного мозга, а также использовать иглу от 2 до следуют тем же путем, что и первый иглу. В идеале, капсула будет кожуру от мозга с обеих оптических долях прилагается так как они имеют важное значение в стабилизации мозга для записи.
- Трахеи, воздушные мешки, и других соединительных тканей, тщательно удаляют с помощью двух прекрасных щипцы чаевые.
- Всего вскрытие должно 3-10 минут
II. Монтаж ЦНС
- Мозг переходит к записи камеры использованием желтого пипетки чаевые.
- В записи камеры, мозг стабилизируется путем размещения платины кадр так, что два прекрасных волос крест в контакт с тканью на стыке между оптическими доли и центральной области мозга.
- Каждый мозг имеет право отдыхать в записи камеры с непрерывной перфузии с кислородом солевой (95% кислорода и 5% углекислого газа), по крайней мере 10 минут. Перфузии камере с кислородом физиологического раствора продолжалась в течение периода записи. Подготовка визуализируется использованием прямой микроскоп (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Германия) с фиксированной сцене и 40x цель погружения воды (Achroplan; числовой апертурой, 0,8; Zeiss) и Номарского оптики. GFP был просмотрен с БП 505-530 флуоресценции фильтр.
III. Электрофизиология
- Пипец в 8-14 МОм используются для записи целого клетка
- Текущий зажим и напряжения зажим записи выполняются с помощью Список EPC7 или Axopatch 200B усилитель, DIGIDATA 1322A цифро-аналоговый преобразователь (Molecular Devices, Foster City, CA), Dell Dimension 8200 компьютеров (Dell Computer, Раунд-Рок, штат Техас), и pClamp 9 программное обеспечение (Molecular Devices).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изолированных целом подготовка мозга мы проиллюстрируем в этом видео позволяет оценить сотовой механизмы, лежащие возбудимости и синаптической передачи в выявленных нейронов, в том числе в обонятельных путей обработки, во взрослом мозге дрозофилы (Gu и О Дауд, 2006). Такой подход является дополнительным к изучению активности нейронов в мозге интактных взрослых дрозофил (Wilson и др. все 2004), во многом так же записи пути из нейронов в мозге млекопитающих, ломтик дополняют записи в себя бодрствовать млекопитающих. Существуют два основных преимущества на месте подготовки мозга летать, когда по сравнению с млекопитающих ломтиками. Первый весь мозг летать легко помещается в записи камеры, так что нет необходимости акцизного небольшой кусочек ткани из большего нейронные цепи, происходит при принятии млекопитающих ломтики мозга. Поэтому нейронные схемы в изолированных мозга Drospohila остаются в основном неизменными. Во-вторых, клеточные тела большинства нейронов находятся вблизи поверхности мозга, легко доступной для всей записи ячейки и они остаются функционально активными при непрерывной перфузии с кислородом физиологический раствор в течение нескольких часов.
Использование записи со стеклянным дном камеры также позволяет идентифицировать специфические нейроны на основе их местоположения и / или GFP выражения. В этой подготовке, записи во время перфузии требует стабилизации мозга. Это не совместимо со стандартными процедурами, в том числе стратегически расположенных золотой проволоки или нейлона сетки, которые являются эффективными для тканей, таких как срезах гиппокампа, в связи с небольшим размером всего головного мозга (~ 1 мм). Поэтому мы предназначены держателя с рамкой платины и нейлона перекрестие возможности для контакта мозга только в двух местах, чтобы минимизировать повреждение нейронов, расположенных вблизи поверхности мозга. Это стабилизирует мозга, либо с передней или задней поверхности вверх и противоположной поверхности только слегка опираясь на этаже записи камеры. С помощью этого устройства мы можем регулярно поддерживать стабильные целом записи ячейки на срок до часа, даже от небольших нейронов в том числе Кеньон клеток, при этом фармакологических манипуляций, которые требуют ванны применения конкретных препаратов. Держатель должен также быть полезными в обеспечении другие небольшие образцы ткани для электрофизиологических исследований, таких как спинной ломтиками шнур от новорожденных грызунов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы была предоставлена программа HHMI профессор Грант DKOD.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Foceps | Tool | Fine Science Tools | No. 11251-10 | Be careful, never damage the fine tips of forceps |
| Papain | Reagent | Worthington Biochemical | 3126 | 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine |
| Dissecting microscope | SMZ-2B Model:C-PS | Nikon Instruments | Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle | |
| Needle & Syringe | PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co | 305175 & 309602 | Cheap and durable | |
| Upright microscope | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp | |
| Patch clamp amplifier | 200 B | Molecular Devices | ||
| Digidata D-A converter | 1322A | Molecular Devices |
References
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
