Summary
चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के phenotype की जांच के लिए एक तेजी से लोकप्रिय उपकरण बन गया है. इस लेख के लिए आनुवंशिक रूप से परिवर्तित एकाधिक माउस एमआरआई प्रयोग चूहों के उच्च throughput phenotyping प्राप्त करने के लिए आवश्यक तरीकों को दिखाता है.
Abstract
चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के साथ माउस phenotyping के क्षेत्र में तेजी से बढ़ रहा है निस्र्पक और मानव रोग के माउस मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए बेहतर उपकरणों के लिए जरूरत से प्रेरित है. एमआरआई आनुवंशिक रूप से परिवर्तित पशुओं की जांच के लिए एक उत्कृष्ट साधन है. यह पूरे दिमाग कवरेज में सक्षम है, vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है, और neuranatomy और शरीर विज्ञान के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए कई विपरीत तंत्र प्रदान करता है. कई चूहों को स्कैन करने की क्षमता के साथ साथ उच्च क्षेत्र स्कैनर के आगमन के साथ ही उपन्यास परिवर्तन के तेजी से phenotyping के लिए अनुमति देता है.
प्रभावी माउस एमआरआई अध्ययन प्रयोग डिजाइन के कई पहलुओं को ध्यान की आवश्यकता होती है. इस अनुच्छेद में, हम सामान्य विधियों का वर्णन करने के लिए माउस एक प्रणाली का उपयोग phenotyping के लिए गुणवत्ता छवियों को प्राप्त होगा कि छवियों को परिरक्षित / संचारित प्राप्त करें रेडियो आवृत्ति में समवर्ती चूहों (आरएफ) एक आम चुंबक में coils (Bock एट अल., 2003). हम संरचनात्मक phenotyping, एक महत्वपूर्ण और सुलभ अनुप्रयोग है कि हमारे इमेजिंग केंद्र में कई माउस मॉडल में प्रभाव के लिए उच्च क्षमता से पता चला है पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित. इससे पहले कि हम ऐसी छवियों के अधिग्रहण के लिए विस्तृत कदम प्रदान कर सकते हैं, vivo में मस्तिष्क इमेजिंग (Dazai एट अल., 2004) और पूर्व vivo मस्तिष्क इमेजिंग (स्प्रिंग एट अल., 2007) है कि ध्यान दिया जाना चाहिए चाहिए में दोनों के लिए महत्वपूर्ण व्यावहारिक विचार कर रहे हैं. ये नीचे चर्चा कर रहे हैं.
Protocol
1. Vivo ब्रेन इमेजिंग में एकाधिक माउस:
जब इमेजिंग जीवित पशुओं, कई प्रमुख विशेषताओं इमेजिंग सत्र के दौरान उपस्थित होना चाहिए: 1), 2 संज्ञाहरण के एक सुरक्षित विधि) पर्यावरण नियंत्रण और 3) शारीरिक निगरानी. इसके अलावा, जब इमेजिंग एक साथ कई विषयों, और तैयारी और जानवर पदों के reproducibility छवि पंजीकरण की सुविधा के आराम गति के बारे में जटिलताओं जुड़ जाते हैं. नतीजतन, तीन प्रमुख कस्टम घटक डिजाइन थे और गढ़े: एक लोडिंग करने के लिए एमआरआई, एक प्रेरण कक्ष के भीतर आरएफ coils में चूहों को सम्मिलित करने के लिए तैयारी और एम्बेडेड निगरानी के साथ एक मंच करने के लिए स्थिति मानकीकृत सुराग की सुविधा प्रणाली.
लोड हो रहा है सिस्टम:
'माउस हाइव' और 'सरणी लोड हो रहा है': माउस लोडिंग सिस्टम दो प्रमुख भागों के होते हैं. चूहा है हाइव मुख्य समारोह के लिए सात गोजर आरएफ (Varian एनएमआर सिस्टम, Palo Alto, CA) coils चुंबक के अंदर एक हेक्सागोनल सरणी में बोर की स्थिति है. लोड हो रहा है सरणी के लिए पकड़ और अधिक संवेदनाहारी गैस की प्रविष्टि की अनुमति देने के उनके सुझावों के माध्यम से drilled छेद के साथ 50 मिली लीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखे चूहों परिवहन के लिए बनाया गया है. बाद चूहों anesthetized और चुंबक के आसपास के क्षेत्र में एक तैयारी के क्षेत्र में निगरानी उपकरणों को interfaced हैं, वे संशोधित अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डाला जाता है और लोड हो रहा है सरणी पर घुड़सवार. सभी चूहों के बढ़ते के बाद, सरणी लोड हो रहा है और ले जाया एक रेल प्रणाली पर चुंबक में डाला है और तैनात. रेल प्रणाली माउस हाइव के साथ जोड़े को सरणी की अनुमति देता है जब नीचे चुंबक के बोर धकेल दिया है. जब पूरी तरह चुंबक, आरएफ coils के भीतर चतनाशून्य करनेवाली औषधि वितरण प्रणाली पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों गोदी में डाला. ऑक्सीजन के साथ मिश्रित Isoflurane माउस हाइव अंत से नमूना अक्ष के साथ प्रत्येक व्यक्ति का तार के एक ट्यूब के माध्यम से आपूर्ति की है. इस संवेदनाहारी गैस मिश्रण ट्यूबों में बहती है, चूहों अतीत है और एक सक्रिय सफाई लोड हो रहा है सरणी की पीठ (चित्रा 1) से जुड़ी इकाई द्वारा एकत्र की.
प्रेरण चैंबर:
चूंकि इमेजिंग बार तीन घंटे के लिए ले, कम से कम कर सकते हैं पशु तैयारी के समय माउस संज्ञाहरण के लिए जोखिम को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, हम एक कस्टम प्रेरण चैम्बर के लिए तैयार करने की प्रक्रिया को कारगर बनाने (चित्रा 2) विकसित किया है. कस्टम प्रेरण चैम्बर दोनों और कई चूहों के शामिल से निपटने के लिए एक वातावरण बनाता है. स्पष्ट एक्रिलिक से निर्माण, प्रेरण कक्ष सिलिकॉन परितारिका बंदरगाहों selfclosing संवेदनाहारी रिसाव कम से कम सुविधाओं और विशेष दस्ताने के लिए की आवश्यकता के बिना आंतरिक वातावरण का उपयोग करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. पारंपरिक और एक माउस के लिए मुखौटा सर्किट की तुलना में, प्रेरण चैम्बर काफी बड़ी बीस चूहों को घर है और बोझिल ट्यूब और मास्क के लगाव के बिना चूहों से मुक्त हेरफेर के लिए अनुमति देता है. इकाई संवेदनाहारी गैस के एक निरंतर प्रवाह है जो एक निष्क्रिय सफाई प्रणाली का उपयोग करने के लिए एकत्र किया जाता है के साथ आपूर्ति की है. प्रतिरोधक हीटिंग तत्वों कक्ष के फर्श गर्मी की तैयारी के दौरान 'जानवरों के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाता है.
स्लेज:
एमआरआई के लिए चूहों की तैयारी का सबसे अजीब और समय लेने वाली पहलुओं में से एक electrocardiograph इलेक्ट्रोड (ईसीजी) और मलाशय के तापमान की जांच के आवेदन कर रहे हैं. इसके अलावा, कफ और सुई इलेक्ट्रोड के रूप में पारंपरिक इलेक्ट्रोड, कई जानवर मुद्रा बनाने यह मुश्किल स्थिति मानकीकृत करने के लिए विकृत पाया गया. इसलिए, हम एक कस्टम प्रपत्र सज्जित एम्बेडेड ईसीजी के साथ पोजीशनिंग मंच तैयार, श्वसन और तापमान जांच 'स्लेज' (अमेरिकी पेटेंट 7,146,936) (चित्रा 3) कहा जाता है. मोशन वेल्क्रो फास्टनरों से बना मजबूरी सिर के आंदोलन को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
Vivo में मस्तिष्क इमेजिंग चरणों में एकाधिक माउस:
- सभी माउस अनुसंधान स्थानीय एसीसी (पशु की देखभाल समिति), माउस हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए IACUC (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति) या समकक्ष के अनुमोदन की आवश्यकता है.
- पहचान और पशुओं के वजन के रूप में सभी प्रक्रियाओं और एमआरआई यूनिट में एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (BSC) के तहत किया जाना चाहिए. जानवरों के एक Autoclavable प्लास्टिक के कंटेनर में स्थानांतरित कर रहे हैं और एमआरआई प्रेरण कक्ष के लिए ले जाया.
- चूहे prewarmed 4% isoflurane और 4 एल / मिनट ऑक्सीजन की प्रेरण का उपयोग कक्ष में anesthetized हैं. पशु पूरी तरह से anesthetized कर रहे हैं एक बार वे पंजा चुटकी का जवाब असफल. सीने से फर अगर ईसीजी और तापमान की निगरानी उपकरणों है कि एक कस्टम स्लेज में निर्मित किया गया है के साथ बेहतर संपर्क उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक एक बाल हटानेवाला (नायर) का उपयोग कर निकाल दिया जाता है. ईव साल्वे (आँसू Naturale PM) आँखों को सुखाने को रोकने के लागू है, और लगभग खारा की 0.3 एमएल subcutaneously प्रशासित है जलयोजन बनाए रखने.
- (Omniscan) जी.डी. DTPA BMA कर सकते हैंइस्तेमाल किया जा अगर विपरीत वृद्धि वांछित है. यदि जी.डी.-DTPA के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, यह खारा (अंतिम 300uL मात्रा) में पतला हो जाएगा और आईपी के माध्यम से 1 mmol / किलोग्राम की एक खुराक में एमआर सत्र से पहले दिलाई.
- चूहे तो व्यक्तिगत sleds में लोड कर रहे हैं, सिर पट्टियाँ और ओपन एंडेड 50ml शंक्वाकार ट्यूब स्लाइड में (चित्रा 3) के साथ immobilized. अप करने के लिए 7 लाइव चूहों एक समय में स्कैन किया जा सकता है. एक बार सभी जानवरों शारीरिक जुड़े निगरानी के साथ भरी हुई हैं, चुंबक में isoflurane स्तर सेट 2% और ऑक्सीजन का स्तर 8 एल / मिनट के लिए बोर.
- शंक्वाकार ट्यूबों एक डॉकिंग प्रणाली (चित्रा 1) स्थिति चूहों को प्रत्येक आरएफ चुंबक के केंद्र में तैनात बोर का तार में समान रूप से डिजाइन में बढ़ रहे हैं. एक बार भरा हुआ, 0.9-2% तक isoflurane कम किया जा सकता है. ईसीजी और तापमान प्रत्येक जानवर पर स्कैन के पाठ्यक्रम भर में निगरानी कर रहे हैं. पशु गरम हवा के साथ स्कैन के दौरान गर्म रखा जाता है.
- प्रत्येक तीन आयामी स्कैन के लगभग 3 घंटे की अवधि है. विवरण इस प्रकार हैं: एमएस 2300 और 36 के एमएस TEeff टी.आर. के साथ तेजी से स्पिन गूंज. 8 के एक औसत के साथ ट्रेन लंबाई इको. परिणामस्वरूप छवि संकल्प 125 सुक्ष्ममापी है (चित्रा 4).
- जब स्कैन पूरा हो गया है, पशुओं चुंबक से हटा रहे हैं और एक गर्म प्रेरण 100% ऑक्सीजन के साथ भरा कक्ष में उतार. पशुओं के एक प्लास्टिक सील कंटेनरों में स्थानांतरित कर रहे हैं और एक BSC तहत पहुँचाया. वे एक गर्म मसौदा मुक्त पिंजरे पर रखा जाता है और संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दी.
2. एकाधिक माउस पूर्व vivo ब्रेन इमेजिंग:
तय एमआर इमेजिंग, गति कलाकृतियों से अप्रभावित रहते इमेजिंग की तुलना में उच्च संकल्प को प्राप्त होता है. उच्च संकल्प, तीन आयामी डेटासेट मात्रात्मक जानकारी निकालने में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं और स्वचालित छवि विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. 16 उच्च संकल्प के एमआर डेटासेट में खोपड़ी माउस दिमाग तय रातोंरात स्कैनिंग सत्र में समानांतर अधिग्रहण के लिए एक कस्टम आरएफ कुंडल सरणी विकसित किया गया था.
16-कुंडल पूर्व vivo ब्रेन इमेजिंग सरणी:
एक कस्टम निर्मित solenoid 16-कुंडल सरणी छवि 16 नमूने समवर्ती के लिए बनाया गया था. यह एक पहले छवि तीन नमूने के लिए एक 60mm डालने ढाल सेट में समवर्ती किया प्रोटोटाइप डिजाइन पर सुधार. 8 बारी solenoid coils सिरों पर घाव करने के लिए 26mm की लंबाई से अधिक 10% के भीतर वर्दी संवेदनशीलता प्रदान पर कर रहे हैं और व्यक्तिगत मॉड्यूलर डिब्बों (Idziak और Haeberlen, 1982) के भीतर परिरक्षित. 16 कुंडल डिब्बों (चित्रा 5) फ्रेम, एक साँस मूत्राशय का उपयोग करने के लिए प्रस्ताव कम से कम जो जगह में ढाल के भीतर coils और यह clamps के पदों के लिए इकट्ठा कर रहे हैं.
एकाधिक माउस पूर्व vivo मस्तिष्क इमेजिंग कदम:
- एक anesthetized माउस के दिल के बाएं वेंट्रिकल में ओपन छाती गुहा और डालने के (या सुरक्षा पंख संचार सेट, 25g 3 / 4 एक्स) (ketamine की intraperitoneal इंजेक्शन (150 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिग्रा / किग्रा) के माध्यम से सुई सही कर्ण - शष्कुल्ली. कट.
- 30 एमएल कमरा एक अस्थायी के साथ Transcardiac फ्लश छिड़काव X पीबीएस + 1 μL / एमएल हेपरिन (1000 खासियत / इकाइयों एमएल) + 2 मिमी लगभग 100 एमएल / घंटा की एक प्रवाह दर पर ProHance.
- 30 एमएल 4% पीएफए के साथ फिक्सेशन गुजारें (कमरे के तापमान) + 2 पर 100 मिमी ProHance एमएल / घंटा.
- सिर काटना और त्वचा, निचले जबड़े, कान, उपास्थि नाक टिप को हटा दें.
- प्लेस शेष खोपड़ी संरचना 4% में पीएफए + 4 में 2 मिमी रातोंरात ProHance डिग्री सेल्सियस
- 1X + 0.02% सोडियम azide + 2 मिमी ProHance पीबीएस के लिए स्थानांतरण.
- उच्च संकल्प 7 Tesla पर तीन आयामी एमआरआई स्कैन छिड़काव के बाद 4 दिन और 2.5 महीने की तुलना में अब नहीं के बीच होता है. दिमाग एक solenoid 16 चैनल का तार सरणी (चित्रा 5) में रखा जाता है.
- इमेजिंग पैरामीटर के रूप में निम्नानुसार हैं: टी.आर. 325 एमएस के साथ तेजी से स्पिन गूंज और 30 ms 4 औसत के साथ गूंज 6 की ट्रेन लंबाई के TEeff. अंतिम छवियों 32 सुक्ष्ममापी (चित्रा 6) की एक isotropic संकल्प है और स्कैन की अवधि लगभग 12 घंटे है.
- स्कैनिंग के बाद, 10% में खोपड़ी जगह Formalin + संरक्षण के लिए 2 मिमी ProHance.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. माउस लोडिंग सिस्टम. "सरणी लोड हो रहा है" और "माउस हाइव" एक आम शीसे रेशा रेल प्रणाली के साथ जुड़ा हुआ है.
चित्रा 2 प्रेरण कक्ष.
चित्रा 3). स्लेज, एम्बेडेड निगरानी सेंसर और सिर संयम दिखा. ख) सिर संयम के साथ एक एक स्लेज पर anesthetized माउस संलग्न. स्लेज विधानसभा आसानी से अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्लाइड.
चित्रा 4. Vivo कई मस्तिष्क छवियों में एक 3 घंटे की तीन आयामी स्कैन से प्रतिनिधि.
5 चित्रा 16 नमूनों तय मस्तिष्क की स्कैनिंग के लिए solenoid 16 चैनल का तार सरणी .
चित्रा 6 प्रतिनिधि मस्तिष्क छवि पूर्व vivo.
Discussion
दोनों vivo और पूर्व vivo माउस इमेजिंग सिस्टम एक ही बार में छवि एकाधिक विषयों के लिए इमेजिंग समय में वृद्धि के बिना इमेजिंग अध्ययन के throughput में काफी वृद्धि में. दोनों vivo और पूर्व vivo एकाधिक माउस इमेजिंग तकनीक से मस्तिष्क छवियों उच्च गुणवत्ता के हैं और माउस मस्तिष्क में मुख्य और लघु संरचना क्रमशः phenotyping के लिए उपयुक्त हैं .
जानवर कई नमूनों की तैयारी के समय को कम करने के लिए, प्रक्रियाओं के parallelization अत्यंत महत्व का है. उदाहरण के लिए, शामिल चैम्बर के विकास के कई नमूनों के साथ - साथ शामिल होने के लिए अनुमति दी, स्लेज और ईसीजी और तापमान जांच के आवेदन सिंक्रनाइज़ कर लिया है, जबकि शरीर पोजीशनिंग मानकीकरण. इसके अलावा, हमारे पूर्व vivo इमेजिंग प्रणाली हमें सक्षम बनाता है जो उच्च throughput phenotyping अध्ययन के लिए आदर्श है एक बार में 16 तय पूरे दिमाग के उच्च संकल्प तीन आयामी छवियों के अधिग्रहण है.
Vivo इमेजिंग सिस्टम में हमारे संभव सीमाओं के लिए व्यक्तिगत संवेदनाहारी और प्रत्येक माउस के लिए तापमान नियंत्रण करने में असमर्थता शामिल हैं. यदि आवश्यक व्यक्तिगत चतनाशून्य करनेवाली औषधि नियंत्रण प्रत्येक माउस के लिए अनन्य संवेदनाहारी vaporizers के अलावा के साथ लागू किया जा सकता है. Vivo इमेजिंग प्रणाली में की एक और सीमा है कि स्कैनिंग चूहों कि कम से कम लगभग 32 ग्राम कर रहे हैं के लिए प्रतिबंधित है. हालांकि, वहाँ वर्तमान में योजना कुंडल के आकार को बढ़ाने के लिए बड़े जानवरों को समायोजित है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के बीमार बच्चे के लिए हॉस्पिटल और टोरंटो विश्वविद्यालय में माउस इमेजिंग सेंटर (चूहों) का हिस्सा है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP (AErrane) | Baxter Internationl Inc. | CA2L9108 | |
| NAIR | Church & Dwight Co. | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | DIN 02082519 | |
| Omniscan (gadodiamide injection USP) | GE Healthcare | J-110A | |
| Custom Sleds | Dazai Research Instruments | ||
| PBS w/o Ca and Mg | Wisent Inc. | 311-010-CL | |
| Heparin 10000USP/10ml | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02264315 | |
| ProHance (gadoteridol injection USP) | Bracco Diagnostics | 11181 | |
| Parafolmadehyde (powder) | Sigma-Aldrich | P-6148-500g | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| Formalin 10% | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M.
- Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI. Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).
- Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).
- Idziak, S., Haeberlen, U. Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR. J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).
