Summary
أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أداة شعبية متزايدة لدراسة النمط الظاهري من الفئران المعدلة وراثيا. هذه المقالة يوضح الأساليب اللازمة لتحقيق الإنتاجية العالية phenotyping من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام عدة الفأر التصوير بالرنين المغناطيسي.
Abstract
ميدان phenotyping الفأر مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هي التي تنمو بسرعة ، بدافع الحاجة إلى أدوات أفضل لتوصيف وتقييم نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب البشر. التصوير بالرنين المغناطيسي هو طريقة ممتازة لتحقيق الحيوانات المعدلة وراثيا. فهي قادرة على تغطية كامل الدماغ ، يمكن أن تستخدم في الجسم الحي ، ويوفر آليات متعددة لتحقيق النقيض من جوانب مختلفة من neuranatomy والفيزيولوجيا. ظهور الماسحات الضوئية عالية الميدان جنبا إلى جنب مع القدرة على تفحص الفئران متعددة في وقت واحد يسمح لphenotyping السريع للطفرات الرواية.
فعالة الماوس دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي تتطلب الانتباه الى جوانب كثيرة من تصميم التجربة. في هذه المقالة ، سنقوم بشرح طرق عامة للحصول على صور عالية الجودة للphenotyping الماوس باستخدام نظام الفئران أن الصور في وقت واحد في محمية تردد الراديو الإرسال / التلقي (RF) الملفوف في المغناطيس الشائعة (بوك وآخرون ، 2003). ونحن نركز بشكل خاص على phenotyping التشريحية ، والتطبيقات الهامة والوصول التي أظهرت قدرة عالية على التأثير في العديد من نماذج الماوس في مركز التصوير لدينا. قبل أن نتمكن من تقديم الخطوات التفصيلية للحصول على مثل هذه الصور ، هناك اعتبارات عملية هامة لكلا التصوير الدماغ في الجسم الحي (Dazai وآخرون ، 2004) ، والتصوير خارج الجسم في الدماغ (ربيع وآخرون ، 2007) أنه ينبغي أن يلاحظ. وتناقش هذه أدناه.
Protocol
1. متعددة الماوس في تصوير الدماغ فيفو :
عند التصوير الحيوانات الحية وميزات رئيسية عديدة يجب أن تكون موجودة في جميع أنحاء دورة التصوير : 1) طريقة آمنة للتخدير ، 2) مراقبة البيئة و 3) الرصد الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك ، عندما موضوعات التصوير متعددة في نفس الوقت ، هناك تعقيدات واضاف فيما يتعلق سهولة وسرعة إعداد واستنساخ الحيوانات من المناصب لتسهيل تسجيل الصورة. وبالتالي ، تم تصميم ثلاثة عناصر رئيسية مخصصة وملفقة : نظام التحميل لادخال الفئران الى داخل لفائف RF التصوير بالرنين المغناطيسي ، وغرفة التعريفي لتسهيل إعداد ومنبرا مع جزءا لا يتجزأ من رصد يؤدي إلى توحيد المواقف.
نظام التحميل :
نظام التحميل الماوس يتكون من جزئين رئيسيين : 'خلية فأر' و 'مجموعة التحميل. وظيفة خلية فأر الرئيسي هو موقف seven أم أربعة وأربعين لفائف الترددات اللاسلكية (فاريان أنظمة الرنين المغناطيسي النووي ، بالو ألتو ، كاليفورنيا) في طائفة سداسية داخل تجويف المغناطيس. تم تصميم مجموعة التحميل لعقد النقل والفئران متعددة يضم أنابيب الطرد المركزي في 50 مليلتر من خلال حفر ثقوب مع نصائح من أجل السماح بدخول الغاز المخدر. بعد تخدير الفئران هي وربطه لمعدات الرصد في مجال إعداد في محيط من المغناطيس ، وإدراجها في أنابيب الطرد المركزي والتي شنت على تعديل الصفيف التحميل. بعد تركيب جميع الفئران ، ويتم نقل الصفيف التحميل وإدراجها في المغناطيس وضعه على نظام السكك الحديدية. نظام السكك الحديدية يسمح للمجموعة لزوجين مع خلية فأر عندما دفعت باستمرار حمل من المغناطيس. عندما أدرجت بالكامل في المغناطيس ، في قفص الاتهام أنابيب الطرد المركزي على النظام التسليم مخدر داخل لفائف الترددات اللاسلكية. ويتم تزويد Isoflurane مختلطة مع الأكسجين من الماوس إلى نهاية خلية العينة عن طريق انبوب بطول محور كل ملف على حدة. هذا الخليط غاز مخدر تصب في أنابيب الماضي ، والفئران والتي يتم جمعها من قبل وحدة نشطة الكسح التي تعلق على الظهر من الصفيف التحميل (الشكل 1).
الحث الغرفة :
منذ العصور التصوير يمكن أن يستغرق فترة تصل الى ثلاث ساعات ، وتقليل الوقت اللازم لاعداد الحيوانات أمر حاسم للحد من التعرض للماوس على التخدير. ومن ثم ، قمنا بتطوير غرفة مخصصة التعريفي لتبسيط عملية إعداد (الشكل 2). غرفة مخصصة تحريض يخلق بيئة واحدة لكلا تحريض ومعالجة الفئران متعددة. شيدت من الاكريليك واضحة ، وملامح غرفة تحريض selfclosing سيليكون المنافذ للحد من تسرب قزحية التخدير ويسمح للمستخدم الوصول إلى البيئة الداخلية دون الحاجة للقفازات خاصة. بالمقارنة مع قناع التقليدية ودوائر للماوس واحدة ، غرفة تحريض كبيرة بما يكفي لمنزل تصل إلى عشرين الفئران ويسمح للتلاعب خالية من الفئران من دون إلحاق أنابيب مرهقة والأقنعة. ويتم تزويد وحدة مع تدفق مستمر من الغاز المخدر الذي يتم جمعها باستخدام نظام المسح السلبي. وتستخدم عناصر التدفئة مقاوم للحرارة أرضية الغرفة للحفاظ على درجة حرارة الحيوانات الجسم أثناء التحضير.
وزلاجات :
واحد من أكثر الجوانب محرجا ومضيعة للوقت إعداد الفئران لتصوير بالرنين المغناطيسي هي تطبيق من الأقطاب الكهربائية (ECG) تخطيط القلب ودرجة الحرارة المسابر المستقيم. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على العديد من الأقطاب الكهربائية التقليدية ، مثل صفعة وأقطاب الإبرة ، لتشويه موقف الحيوان مما يجعل من الصعب توحيد المواقع. دعا التنفس ودرجة الحرارة المسابر بالتالي ، فإننا ضعت منصة مخصصة لتحديد المواقع النموذج مزودة جزءا لا يتجزأ من تخطيط القلب ، و 'مزلقة' (براءة الاختراع الأمريكية 7146936) (الشكل 3). واستخدمت القيود الاقتراح المقدم من السحابات فيلكرو للحد من حركة الرأس.
متعددة الماوس في الخطوات فيفو تصوير الدماغ :
- جميع البحوث الماوس يتطلب المحلية ACC (لجنة رعاية الحيوان) موافقة IACUC (المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام) أو ما يعادلها ، على إجراءات التعامل مع الفأرة.
- يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات مثل تحديد وزنها من الحيوانات تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) وحدة التصوير بالرنين المغناطيسي. يتم نقل الحيوانات في وعاء من البلاستيك autoclavable ونقلها إلى غرفة التصوير بالرنين المغناطيسي التعريفي.
- يتم تخدير الفئران في غرفة تحريض prewarmed باستخدام isoflurane 4 ٪ و 4 لتر / دقيقة من الأوكسجين. تخدير الحيوانات بالكامل مرة واحدة فشلوا في الاستجابة لقرصة مخلب. تتم إزالة الفراء من الصدر باستخدام مزيل الشعر (نير) إذا كان ذلك ضروريا لتوفير اتصال أفضل مع أجهزة تخطيط القلب ومراقبة درجة الحرارة التي تم بناؤها في زلاجات المخصصة. عشية تطبيق مرهم (دموع Naturale PM) الى العيون لمنع جفاف ، ويدار حوالي 0،3 مل من المياه المالحة تحت الجلد للحفاظ على الماء.
- GD - DTPA - BMA (Omniscan) قدان تستخدم اذا كان المطلوب هو تعزيز التباين. إذا GD - DTPA لاستخدامه ، سيتم تخفيفه في (الحجم النهائي 300uL) المالحة وتدار في جرعة واحدة من 1 ملمول / كغم قبل الدورة MR عبر بروتوكول الإنترنت.
- ثم يتم تحميلها في الفئران الزلاجات الفردية ، ثبتوا مع رئيس الأشرطة والانزلاق الى أنبوب 50mL مفتوح العضوية مخروطية الشكل (3). يمكن مسحها يصل إلى 7 الفئران الحية في وقت واحد. حالما يتم تحميل جميع الحيوانات مع رصد الفسيولوجية متصلة ، تعيين مستوى isoflurane في المغناطيس تحمل إلى 2 ٪ ، ومستوى الأكسجين إلى 8 لتر / دقيقة.
- هي التي شنت الأنابيب المخروطية في نظام الالتحام (الشكل 1) مصممة لموقف موحد الفئران في كل لفائف RF المتمركزة في مركز للمغناطيس تتحمل. تحميل مرة واحدة ، يمكن تخفيض isoflurane إلى 0،9-2 ٪. تتم مراقبة تخطيط القلب ودرجة الحرارة على كل حيوان طوال فترة الفحص. يتم الاحتفاظ الحيوانات دافئة أثناء الفحص مع الهواء تحسنت.
- مدة كل مسح ثلاثي الأبعاد هو ما يقرب من 3 ساعات. التفاصيل هي كما يلي : ارتداد سريع تدور مع TR من 2300 مللي ثانية وTEeff من 36 مللي ثانية. صدى طول القطار من 8 مع 1 في المتوسط. أدى القرار 125 ميكرون الصورة (الشكل 4).
- عند اكتمال الفحص ، تتم إزالة هذه الحيوانات من المغناطيس وتفريغها في غرفة دافئة تحريض مليئة بالاوكسجين 100 ٪. يتم نقل الحيوانات في حاويات من البلاستيك مختوم ونقلها تحت ش. يتم وضعها في قفص مشروع الحارة الحرة ، وسمح للتعافي من التخدير.
2. متعددة دماغ الفأر فيفو السابقين التصوير :
تتأثر الحركة الفنية ، التصوير الثابت MR يحقق دقة أعلى من التصوير الحي. عالية الدقة ، وثلاثية الأبعاد قواعد البيانات توفر المرونة القصوى في استخراج المعلومات الكمية والسماح لتحليل الصور آليا. وقد تم وضع لفائف الترددات اللاسلكية المخصصة لاقتناء مجموعة موازية من 16 MR مجموعات البيانات عالية الدقة ثابتة داخل الجمجمة في أدمغة فئران بين عشية وضحاها دورات المسح.
في السابق فيفو 16 فائف الدماغ التصوير صفيف :
وأنشئت مجموعة مبنية خصيصا اللولبي 16 لفائف لعينات 16 صورة في وقت واحد. هذا التصميم يحسن بناء على النموذج الأولي في وقت سابق استخدامها لثلاث عينات الصور في وقت واحد في مجموعة إدراج التدرج 60mm. لفائف اللولبي 8 بدوره أكثر من جرح في تاريخ لتوفير الحساسية موحدة لحدود 10 ٪ على مدى طول 26mm ومحمية بشكل فردي داخل المقصورات وحدات (Idziak وHaeberlen ، 1982). يتم تجميعها في مقصورات لفائف من 16 إلى إطار (الشكل 5) ، والمواقف التي لفائف داخل الانحدار والمشابك في مكانها باستخدام المثانة الهوائية لتقليل الحركة.
متعددة دماغ الفأر الخطوات فيفو السابقين التصوير :
- فتح تجويف الصدر وادخال ابرة (أو مجموعة السلامة التسريب مجنح ، 25G X 3 / 4) في البطين الأيسر من القلب لتخدير الماوس (عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (150 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) . قص الأذن اليمنى.
- Transcardiac نضح الاحمرار مع 30 مل مؤقت الغرفة 1 + 1 X PBS ميكروليتر / مل الهيبارين (USP 1000 وحدة / مل) + ProHance مم 2 بمعدل تدفق ما يقرب من 100 مل / ساعة.
- تمرير التثبيت مع PFA مل 30 4 ٪ (درجة حرارة الغرفة) + 2 مم ProHance في 100 مل / ساعة.
- قطع رأس وإزالة الجلد ، والفك السفلي والأذنين والأنف غيض الغضروفية.
- الهيكل مكان الجمجمة المتبقية في 4 ٪ + PFA ProHance 2 مم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- نقل لبرنامج تلفزيوني 1X + أزيد الصوديوم 0.02 ٪ + ProHance 2 مم.
- ارتفاع القرار three المسح بالرنين المغناطيسي في تسلا الأبعاد 7 يحدث بين 4 أيام وليس شهورا أطول من 2.5 بعد نضح. يتم وضعها في أدمغة مجموعة اللولبي لفائف 16 قناة (الشكل 5).
- معلمات التصوير هي كما يلي : ارتداد سريع تدور مع TR 325 مللي ثانية وTEeff من 30 مللي ثانية ، وطول القطار صدى 4 6 مع المتوسطات. الصور النهائية لها قرار موحد الخواص من 32 ميكرومتر (الشكل 6) ومدة المسح ما يقرب من 12 ساعة.
- بعد المسح ، ومكان الجمجمة في الفورمالين 10 ٪ + 2 ProHance ملم لحفظها.
3. ممثل النتائج :
الشكل 1. تحميل الماوس والنظام. في "مجموعة تحميل" و "خلية الفأر" متصلا مع النظام الموحد للسكك الحديدية من الألياف الزجاجية.
الشكل 2. غرفة التعريفي.
الشكل 3. أ) زلاجات ، والتي تبين أجهزة الاستشعار المدمجة رصد وضبط النفس في الرأس. ب) تخدير الماوس على زلاجات من ضبط النفس مع رئيس المرفقة. الجمعية زلاجات الشرائح بسهولة في أنبوب الطرد المركزي.
الشكل 4. في الجسم الحي صور متعددة من ثلاث ساعات 3 تفحص الأبعاد.
الشكل 5 16 قناة مجموعة لفائف اللولبي لمسح الدماغ من 16 عينات ثابتة.
الشكل 6. الممثل صورة الدماغ السابقين فيفو.
Discussion
على حد سواء في الجسم الحي وخارج الجسم الحي الماوس صورة نظم التصوير مواضيع متعددة في آن واحد لزيادة الإنتاجية من الدراسات التصوير دون زيادة كبيرة في وقت التصوير. الصور من كل من الدماغ في الجسم الحي وخارج الجسم الحي تقنيات التصوير متعددة الماوس ذات جودة عالية ومناسبة لphenotyping الهياكل الرئيسية والثانوية في مخ الفأر على التوالي.
لتقليل الوقت اللازم لإعداد الحيوان عينات متعددة ، والموازاة من العمليات ذات أهمية قصوى. على سبيل المثال ، وتطوير الغرفة التعريفي يسمح للتحريض على عينات متعددة في وقت واحد ، وزلاجات وقد تزامن تطبيق تخطيط القلب ودرجة الحرارة أثناء تحقيقات لتحديد المواقع توحيد الجسم. وعلاوة على ذلك ، لدينا نظام التصوير السابقين فيفو تمكننا من الحصول على ثلاث صور عالية الدقة ثلاثية الأبعاد من أدمغة 16 كلها ثابتة في وقت واحد والذي يعتبر مثاليا للدراسات phenotyping الإنتاجية العالية.
قيود محتملة لدينا نظام التصوير في فيفو وتشمل عدم القدرة على التحكم في درجة الحرارة وحدة التخدير لكل الماوس. يمكن إذا أن تنفذ المطلوب السيطرة الفردية مخدر مع اضافة التبخير مخدر الحصري لكل الماوس. آخر قيود على نظام التصوير في الجسم الحي هو أن يقتصر المسح على الفئران التي هي أقل من حوالي 32 غراما. ومع ذلك ، هناك خطة حاليا لزيادة حجم الملف لاستيعاب أكبر الحيوانات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل هو جزء من مركز التصوير ماوس (الفئران) في مستشفى الأطفال المرضى ، وجامعة تورنتو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP (AErrane) | Baxter Internationl Inc. | CA2L9108 | |
| NAIR | Church & Dwight Co. | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | DIN 02082519 | |
| Omniscan (gadodiamide injection USP) | GE Healthcare | J-110A | |
| Custom Sleds | Dazai Research Instruments | ||
| PBS w/o Ca and Mg | Wisent Inc. | 311-010-CL | |
| Heparin 10000USP/10ml | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02264315 | |
| ProHance (gadoteridol injection USP) | Bracco Diagnostics | 11181 | |
| Parafolmadehyde (powder) | Sigma-Aldrich | P-6148-500g | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| Formalin 10% | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Bock, N. A., Konyer, N. B., Henkelman, R. M.
- Dazai, J., Bock, N. A., Nieman, B. J., Davidson, L. M., Henkelman, R. M., Chen, X. J. Multiple mouse biological loading and monitoring system for MRI. Magn. Reson. Med. 52, 709-715 (2004).
- Spring, S., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Sexual dimorphism revealed in the structure of the mouse brain using three-dimensional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 35, 1424-1433 (2007).
- Idziak, S., Haeberlen, U. Design and construction of a high homogeneity rf coil for solid-state multiple-pulse NMR. J. Magn. Reson. 50, 281-288 (1982).
