מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

Summary

דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לכלי פופולרי יותר ויותר לבחינת הפנוטיפ של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מדגים את שיטות הדרושים כדי להשיג תפוקה גבוהה phenotyping של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות מרובות עכבר MRI.

Abstract

תחום phenotyping עכבר עם תהודה מגנטית (MRI) הוא הולך וגדל במהירות, מונע על ידי הצורך של כלים משופרים לאפיון והערכה של מודלים העכבר של מחלות אנושיות. MRI הוא שיטת מצוין חוקרת בעלי חיים שינו גנטית. הוא מסוגל כיסוי המוח כולו, ניתן להשתמש in vivo, ומספקת מנגנוני בניגוד מרובים על חקירת היבטים שונים של neuranatomy ופיזיולוגיה. הופעת גבוהה בתחום סורקי יחד עם היכולת לסרוק עכברים מרובים בו זמנית מאפשר phenotyping מהיר של מוטציות חדשות.

אפקטיבי עכבר מחקרים MRI דורשים תשומת לב להיבטים רבים של תכנון הניסוי. במאמר זה, נתאר שיטות כלליות לרכוש תמונות באיכות phenotyping העכבר באמצעות מערכת דימויים עכברים במקביל תדר לשדר / לקבל מוגן רדיו (RF) סלילי מגנט משותף (Bock et al., 2003). אנו מתמקדים בעיקר על phenotyping אנטומי, יישום חשוב ונגיש כי הראו פוטנציאל גבוה ההשפעה במודלים של העכבר רבים במרכז ההדמיה שלנו. לפני שנוכל לספק את הצעדים המפורטים לרכוש תמונות כאלה, ישנם שיקולים מעשיים חשובים הן in vivo המוח הדמיה (Dazai et al. 2004) לשעבר vivo המוח הדמיה (אביב et al. 2007) כי יש לציין. אלה הם בהמשך.

Protocol

1. עכבר מרובות ב-vivo הדמיה מוחית:

כאשר בעלי חיים הדמיה חיים, תכונות עיקריות מספר חייב להיות נוכח בכל הפגישה הדמיה: 1) שיטה בטוחה של הרדמה, 2) בקרה סביבתית 3) ניטור פיזיולוגי. יתר על כן, כאשר הנבדקים הדמיה מרובים בו זמנית, יש להוסיף המורכבות לגבי הקלות והמהירות של ההכנה ואת שחזור של תפקידים בעלי חיים כדי להקל על רישום התמונה. כתוצאה מכך, שלושת המרכיבים העיקריים אישית תוכננו מפוברק: מערכת טעינת להכניס את העכברים לתוך סלילי RF בתוך ה-MRI, תא אינדוקציה כדי להקל על הכנת פלטפורמה עם ניטור מוטבע מוביל לתקנן משרה.

המערכת טוען:

מערכת טעינת העכבר מורכב משני חלקים עיקריים: "עכבר הכוורת 'ו' מערך הטעינה". הפונקציה העיקרית כוורת של העכבר למצב seven מרבה רגליים סלילי RF (NMR וריאן מערכות, בפאלו אלטו, קליפורניה) במערך משושה בתוך המגנט לשעמם. מערך הטעינה נועד להחזיק תחבורה עכברים רבים שוכנו 50 מבחנות צנטריפוגה למיליליטר עם חורים שנקדחו באמצעות הטיפים שלהם כדי לאפשר כניסה של גז הרדמה. לאחר בעכברים מורדמים ו interfaced לציוד מעקב באזור הכנה בקרבת המגנט, הם מוכנסים לתוך צינורות צנטריפוגה שונה ועלה על מערך הטעינה. לאחר הרכבה כל העכברים, מערך הטעינה מועבר ונוסף המגנט ואת מיקומו על מערכת הרכבות. מערכת הרכבות מאפשר מערך לזוג עם הכוורת העכבר כאשר דחף את ילדה של המגנט. כאשר מוכנס במלואו לתוך המגנט, צינורות צנטריפוגה המזח אל מערכת המסירה הרדמה בתוך סלילי RF. Isoflurane מעורבב עם חמצן מסופק מסוף כוורת העכבר כדי הדגימה דרך צינור לאורך ציר של סליל בנפרד. זו תערובת גז ההרדמה זורם לתוך הצינורות, בעבר העכברים והוא נאסף על ידי יחידה הדחה פעיל המחובר לחלק האחורי של מערך טעינה (איור 1).

לשכת אינדוקציה:

מאז ימי הדמיה יכול להימשך עד שלוש שעות, צמצום זמן ההכנה חיים הוא חיוני כדי להגביל את החשיפה של העכבר כדי הרדמה. לכן, פיתחנו קאמרית אינדוקציה מותאמים אישית כדי לייעל את תהליך הכנה (איור 2). חדר אינדוקציה אישית יוצר סביבה יחיד והן לזירוז הטיפול בעכברים מרובים. נבנה מתוך אקריליק ברור, לשכת הגיוס תכונות selfclosing סיליקון יציאות איריס כדי למזער זליגת הרדמה מאפשר למשתמש לגשת הסביבה הפנימית ללא צורך כפפות מיוחדות. לעומת המסכה מעגלים קונבנציונלי עבור עכבר בודדת, לשכת הגיוס הוא גדול מספיק לבית עד עשרים עכברים מאפשר מניפולציה חינם של העכברים ללא הקובץ המצורף של צינורות ומסכות מסורבלת. היחידה מסופקת עם זרימה קבועה של גז הרדמה אשר נאסף באמצעות מערכת הדחה פסיבי. גופי חימום Resistive משמשים כדי לחמם את הרצפה של חדר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים במהלך ההכנה.

המזחלת:

אחד ההיבטים המביכים ביותר זמן רב להכנת עכברים עבור ה-MRI הם יישום של electrocardiograph (אק"ג) אלקטרודות בדיקות טמפרטורה רקטלית. בנוסף, רבים של אלקטרודות קונבנציונלי, כגון חפתים אלקטרודות מחט, נמצאו לעוות תנוחה של החיה ומקשה לתקנן מיצוב. לכן, אנו פיתח פלטפורמה אישית צורה מצויד עם מיצוב מוטבע א.ק.ג., הנשימה בדיקות טמפרטורה שנקרא "מזחלת" (פטנט אמריקאי 7146936) (איור 3). מגבלות תנועה עשויים מחברים סקוטש שימשו כדי להגביל את תנועת הראש.

עכבר מרובה בתחום ההדמיה צעדים vivo המוח:

1. כל מחקר העכבר דורש המקומי ACC (ועדת טיפול בבעלי חיים), IACUC (Animal Care מוסדיים ועדת שימוש) או שווה ערך אישור הליכי הטיפול העכבר.
2. כל הנהלים כגון זיהוי במשקל של בעלי חיים צריכה להתבצע תחת הממשלה בטיחות ביולוגית (BSC) ו ביחידת ה-MRI. הקופים והחתולים מועברים לתוך מיכל פלסטיק autoclavable והובל לתא אינדוקציה MRI.
3. עכברים מורדמים בתא prewarmed באמצעות אינדוקציה 4% isoflurane ו 4 L / min חמצן. בעלי חיים מורדמים לגמרי ברגע שהם אינם מגיבים לצבוט כפה. פרווה מהחזה מוסר באמצעות מסיר שיער (Nair) אם יש צורך לספק מגע טוב יותר עם א.ק.ג. ניטור טמפרטורה מכשירים שנבנו לתוך המזחלת מותאמת אישית. משחה חוה (דמעות Naturale PM) מוחל על העיניים כדי למנוע התייבשות, וכ 0.3 מ"ל של תמיסת מלח מנוהל מתחת לעור לשמור על הלחות.
4. ה-DTPA-BMA (Omniscan) עשוילשמש אם הוא שיפור לעומת הרצוי. אם אלוקים-DTPA היא לשמש, זה יהיה מדולל (נפח סופי 300uL) מליחים מנוהל במנה אחת של 1 מילימול / ק"ג לפני הפגישה MR דרך IP.
5. עכברים נטענים מכן לתוך מזחלות בודדים, משותקת עם רצועות הראש והחלק לשפופרת 50 מ"ל פתוחות חרוטי (איור 3). עד 7 עכברים חיים ניתן לסרוק בבת אחת. לאחר כל בעלי החיים עמוסים ניטור פיזיולוגי קשור, להגדיר את רמת isoflurane בתוך המגנט ילדה 2% ורמת החמצן 8 L / min.
6. צינורות חרוטי מורכבים לתוך מערכת עגינה (איור 1) נועד עכברים עמדה אחידה לתוך סליל כל RF ממוקם במרכז המגנט לשעמם. טעון פעם, isoflurane ניתן לצמצם 0.9-2%. א.ק.ג. וטמפרטורה מנוטרים על כל חיה לאורך הקורס של הסריקה. בעלי חיים נשמרים חמים במהלך הסריקה עם האוויר התחמם.
7. משך לסרוק כל אחד משלושת מימדי הוא כ 3 שעות. הפרטים הם כדלקמן: הד ספין מהיר עם TR של 2300 ms ו TEeff של 36 מילישניות. אקו אורך הרכבת של 8 עם ממוצע 1. רזולוציית התמונה המתקבלת היא 125 מיקרומטר (איור 4).
8. לאחר השלמת הסריקה, החיות יוסרו מן המגנט פרקו בתא אינדוקציה חמה מלא 100% חמצן. הקופים והחתולים מועברים לתוך מיכלים אטומים מפלסטיק מועבר תחת BSC. הן ממוקמות על כלוב טיוטה חם חופשי ואיפשר להתאושש מן ההרדמה.

2. מרובה עכבר לשעבר vivo הדמיה מוחית:

מושפע ההצעה artifacts, קבוע MR הדמיה משיגה רזולוציה גבוהה יותר מאשר הדמיה לחיות. ברזולוציה גבוהה, תלת ממדי מערכי נתונים מספקים גמישות מקסימאלית של חילוץ מידע כמותי ולאפשר ניתוח התמונה אוטומטית. מערך סליל אישית RF פותחה במקביל לרכישת 16 מערכי נתונים של רזולוציה גבוהה של MR קבוע, גולגולת המוח העכבר טיפולים לילה.

16-Coil vivo לשעבר מערך דימות המוח:

שהותקן 16-סליל מערך סולנואיד נוצר כדי 16 דגימות התמונה בו זמנית. עיצוב זה משפר על אב טיפוס מוקדם יותר בשימוש עד שלוש דגימות התמונה במקביל ערכה להכניס 60mm הדרגתי. 8 פרסה סלילי סולנואיד הם על הפצע בקצוות כדי לספק רגישות אחידה בתוך 10% לאורך של 26mm ו מוגן בנפרד בתוך תאים מודולרית (Idziak ו Haeberlen, 1982). 16 תאים סליל מורכבים למסגרת (איור 5), אשר ממקמת את הסלילים בתוך השיפוע ו מהדק אותו במקום באמצעות שלפוחית ​​השתן פנאומטי כדי למזער את התנועה.

מרובה עכבר לשעבר הדמיה vivo המוח את הפעולות הבאות:

1. חלל החזה הכנס פתח מחט (או עירוי מכונפת בטיחות להגדיר, 25 גרם X 3 / 4) אל תוך החדר השמאלי של הלב של העכבר הרדים (באמצעות הזרקה intraperitoneal של קטמין (150 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) . חותכים את אפרכסת ימין.
2. זלוף Transcardiac מיושר עם טמפ 'חדר 30 מ"ל 1 + 1 X PBS μL / מ"ל ​​הפרין (1000 יחידות USP / מ"ל) + 2 ProHance mM בקצב הזרימה של כ 100 מ"ל / שעה.
3. לעבור קיבוע עם 30 מ"ל PFA 4% (טמפרטורת החדר) + 2 ProHance מ"מ 100 מ"ל / שעה.
4. לערוף ולהסיר עור, הלסת התחתונה, האוזניים, האף קצה סחוסי.
5. המקום הנותר מבנה הגולגולת ב 4% PFA + 2 mM ProHance לילה בשעה 4 ° C.
6. העברה 1X PBS + אזיד הנתרן 0.02% + 2 ProHance מ"מ.
7. רזולוציה גבוהה three סריקת MRI ממדי ב 7 טסלה מתרחשת בין 4 ימים ולא יותר מ 2.5 חודשים לאחר זלוף. המוח ממוקמים מערך 16 ערוצים סולנואיד הסליל (איור 5).
8. הפרמטרים הדמיה הן כדלקמן: הד ספין מהיר עם TR 325 ms ו TEeff של 30 אורך ms הד, רכבת של 6 עם 4 ממוצעים. התמונות הסופית יש איזוטרופיים ברזולוציה של 32 מיקרומטר (איור 6) ואת משך הסריקה הוא כ 12 שעות.
9. לאחר הסריקה, במקום גולגולת ב -10% פורמלין + 2 ProHance mM לשימור.

3. נציג תוצאות:

באיור 1. מערכת טעינת העכבר. "מערך טעינה" ו "עכבר כוורת" מחובר עם מערכת מסילה משותפת פיברגלס.

איור 2. קאמרית אינדוקציה.

איור 3.) מזחלת, מראה חיישני ניטור משובצים ו איפוק הראש. ב) עכבר הרדים על מזחלת באיפוק ראש המצורפת. הרכבה מזחלת בקלות שקופיות לתוך הצינור צנטריפוגות.

איור 4. in vivo תמונות המוח מספר אחד 3 שעות סריקה תלת מימדי.

איור 5. 16 ערוצים סליל סולנואיד מערך סריקה של 16 דגימות מוח קבוע.

איור 6. הדימוי נציג לשעבר vivo המוח.

Discussion

הן in vivo לשעבר vivo עכבר מערכות הדמיה נושאים מספר תמונות בבת אחת כדי להגדיל את התפוקה של בדיקות הדמיה מבלי להגדיל במידה ניכרת את זמן הדמיה. התמונות מוח משני in vivo ו-ex vivo מרובים עכבר שיטות הדמיה הם באיכות גבוהה ומתאימים phenotyping מבנים ראשיות ומשניות במוח העכבר בהתאמה.

כדי למזער את זמן הכנת החיה של דגימות מרובות, הקבלה של תהליכים הוא בעל חשיבות עליונה. לדוגמה, פיתוח של החדר אינדוקציה מותר לזירוז של דגימות מרובים בו זמנית, ועל מזחלת יש לסנכרן את היישום של בדיקות א.ק.ג. ואת הטמפרטורה בעוד סטנדרטיזציה מיקום הגוף. יתר על כן, המערכת שלנו לשעבר vivo הדמיה מאפשר לנו לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה three ממדי של 16 מוחות כל קבוע בכל זמן שבו הוא אידיאלי עבור תפוקה גבוהה מחקרים phenotyping.

מגבלות אפשריות שלנו במערכת הדמיה vivo כוללים חוסר יכולת לשלוט בנפרד הרדמה טמפרטורה עבור כל עכבר. אם נדרש הפרט הרדמה מלאה יכול להיות מיושם עם תוספת של חומר הרדמה vaporizers בלעדי עכבר אחד. מגבלה נוספת של מערכת הדמיה vivo היא סריקה מוגבל עכברים, כי הם פחות כ 32 גרם. עם זאת, קיימת כיום תוכנית להגדיל את גודל סליל כדי להתאים בעלי חיים גדולים יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)	Baxter Internationl Inc.	CA2L9108
NAIR	Church & Dwight Co.
Tears Naturale P.M.	Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)	GE Healthcare	J-110A
Custom Sleds	Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg	Wisent Inc.	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)	Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)	Sigma-Aldrich	P-6148-500g
Sodium Azide	Fisher Scientific	S227-100
Formalin 10%	Fisher Scientific	SF100-4