Summary
C57BL / 6 möss har använts för att studera Hc patogenes och ge den bästa modellen. Vi undersöker de potentiella fördelarna av humorala immuniteten mot denna svamp och genererade flera MAbs [till histon H2B och ett heat shock 60kDa protein] som vi testade för deras skyddseffekt efter intraperitoneal administrering.
Abstract
Syftet med användningen av denna metod är 1) att avancera vår förmåga att skydda enskilda med antikroppar eller vaccin för att förebygga eller behandla histoplasmos orsakas av svampen histoplasma capsulatum och 2) att undersöka betydelsen av virulensfaktorer som mål för behandling. För att generera MAbs, möss är vaccinerade, är immunsvaret bedömas med en fast fas ELISA system som utvecklats i vårt laboratorium, och de bästa responder möss väljs för isolering av splenocytes för fusion med hybridom celler. C57BL / 6 möss har i stor utsträckning använts för att studera H. capsulatum patogenes och ge den bästa modellen för att erhålla de nödvändiga uppgifterna. För att bedöma den roll som MAbs i infektionen, möss är intraperitonealt administreras med antingen mAb till H. capsulatum eller isotyp matchad kontrollgrupp MAB och sedan smittade av antingen intravenöst (iv), intraperitoneal (ip) eller intranasal (i) rutter. I den vetenskapliga litteraturen, bygger effekten av MAbs mot svampinfektioner i möss på mortalitet som en slutpunkt, i samband med enheter koloni formin (CFU) bedömningar vid tidigare tidpunkter. Överlevnad (tid till dödsfall) studier är nödvändiga som de bäst representerar mänskliga sjukdomar. Således skulle effekten av våra insatser inte tillräckligt fastställas utan överlevnadskurvorna. Detta gäller även för att fastställa effekten av vaccinet eller testning av mutanter för virulens. Med histoplasmos, mössen ofta gå från att vara energisk för att döda under flera timmar. Kapaciteten i en intervention som administrationen av en mAb kan initialt skydda ett djur från sjukdomen, men sjukdomen kan återfall som inte skulle realiseras i korta CFU experiment. Förutom överlevnad och svamp analyser börda undersöker vi inflammatoriska svar på infektion (histologi, cell-rekrytering, cytokin svar). För överlevnad / tid till död experiment, är de möss som blivit infekterade och kontrolleras minst två gånger dagligen för tecken på sjuklighet. För att bedöma svamp börda, histopatologi och svar cytokin, är de möss euthanized vid olika tidpunkter efter infektion. Djurförsök utförs enligt riktlinjerna för Institute for Animal Studier av Albert Einstein College of Medicine.
Protocol
1. Tillväxten av H. Capsulatum
- Förbered en biosäkerhet skåp för arbetet med svampen genom att rengöra skåpet med 10% blekmedel följt av 20 min UV-strålning. H. capsulatum i jästen fas kräver biosäkerhetsnivå (BSL) II praxis, medan formen form kräver BSLIII. Använd jäst form i följande steg.
- Nästa förbereda en 15 ml koniska rör med 5 ml PBS. Harvest en koloni av H. capsulatum (stam Hc ATCC G217B) från en BHI blod agarplatta [glukos 10 g / L, cystein 0,1 g / L, penicillin-streptomycin 1% och får röda blodkroppar 50 ml / l (Colorado Serum Co, Colorado, USA) ] odlas vid 37 ° C eller ta en alikvot av fryst jäst lager vid -80 ° C och tillsätt det till PBS. Vortex cellerna kraftfullt och centrifugera i 1100 xgi 10 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten och lägga 10mL av färsk PBS. Upprepa denna procedur tre gånger. Häng upp cellerna i 5 ml PBS och flytt till en 50 ml koniska rör.
- Att störa aggregerade celler, passera suspensionen jäst cell genom en 26 G1 / 2 st u sjunga en 10ml-spruta 5 gånger i biosäkerhet skåp (med ansikts skydd). Att isolera små, jämnstora jäst, centrifugera celler vid 55 xg under 1 minut vid rumstemperatur och ta sedan bort de 1 ml.
- Lägg till cellsuspension till en steril Erlenmeyerkolv innehåller 100 ml HAM F12 medium (GIBCO) kompletteras med 16g / L glukos, 1g / L glutaminsyra, 8.4mg / L cystin, 6g / L glutaminsyra och sedan växa cellerna vid 37 ° C i 48 timmar i en inkubator med 150rpm skakning.
2. Hybridomteknik Tillväxt och rening av monoklonala antikroppar
- Överför valda hybridomceller att DMEM medium som innehåller 10% fetalt kalvserum, 10% NCTC, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% Penicillin-streptomycin. Odla celler i en cellkultur kolv (Becton Dickenson) i 5-7 dagar vid 37 ° C / 5% CO 2.
- Centrifugera sedan mediet vid 1100 xgi 10 minuter i rumstemperatur och samla in alla supernatanten utan att störa pellets.
- Därefter renar cellen fria supernatanten med hjälp av ett protein A / G kåda av FPLC.
- Den mAb Koncentrationen kan då beräknas genom en ELISA (1) med en IgG isotypisk kontroll som standard (Figur 1B).
3. Histoplasma capsulatum Vaccin Förberedelser
- Ta en 48 h histoplasma capsulatum (stam Hc ATCC G217B) Jästkulturer fas odlas i HAM F-12 medium.
- Centrifugera cellerna vid 1100 xgi 10 min. Kassera supernatanten och tillsätt färsk PBS.
- Upprepa proceduren 3,2 3 gånger.
- Pass jästen cellsuspension 5 gånger genom en 26G1 / 2 nål med en spruta.
- Centrifugera suspensionen vid 55 xgi 1 min till pellets kvarvarande cell kluster. Överför supernatanten som innehåller den enda cellsuspension till ett nytt rör.
- Räkna upp de enda cell suspensionen med hematocytometer.
- Justera cellkoncentrationen för att uppnå 1,25 x 10 7 jäst (överlevnad) eller 5,0 x 10 6 (CFU, cytokiner och histologi) i en suspention <50 mikroliter (bild 2).
4. Intraperitoneal administrering av MAbs
- Plocka upp musen genom att svansen och nackskinnet (Fig. 3A). Immobilisera musen i nackskinnet av sin hals så nära theears som möjligt (se till att ta upp tillräckligt med huden så att musen cannotturn huvudet för att bita den som hanterar det, figur 3B och 3C).
- Stabilisera svansen withthe lillfingret försiktigt tryckt mot handflatan (Figur 3D).
- Tvätta injektionsstället med 70% etanol innan du placerar nålen och att aspirera för att leta efter blod innan injicering.
- Använd 26G1 / 2 till piercethe hud och abdominalmuscles att injicera mAb lösning innehållande 500μg (PBS, isotypisk kontroll antikropp eller mAb som ska testas, utspädd i 1 mL PBS) i thelower vänster eller nedre högra delen av buken kvadranten (intraperitoneal kavitet), med djuret i huvudet nere, ta hand för att undvika att membranet andother inre organ (figur 3E).
- Vänta en kort stund innan han avhämtar needleto minska risken för läckage.
- Vänta minst två timmar innan man går vidare till nästa steg.
5. Mus Anestesi och Intranasal Infektioner
- Förbered anestesi med ketamin och xylazin på 100 mg / kg och 10 mg / kg, respektive. Utför intraperitoneal administration av PBS, isotypisk kontroll antikroppar, eller experimentell antikroppar som beskrivs i den skriftliga medföljande protokollet. Vänta två timmar efter mAb injektionen innan anesthetizing musen och går vidare med intranasal infektion.
Förbered anestesi med ketamin och xylazin på 100 mg / kg och 10 mg / kg (7). - Under 2h väntetid, förbereda histoplasma capsulum inokulatet som beskrivs i den skriftliga medföljande protokollet.
- Fortsätt enligt itens 5,1 till 5,5. Toe nypa djuren med en pincett och för att kontrollera frånvaron av reflex och bekräfta att bedövningen fungerade. Efter anaesthetization försiktigt dra musen genom dess framtänder till en nylon eller bomull sträng. Använd 2 kolumn står att knyta strängarna för att skjuta djuren.
- Sakta administrera ca 50 l inokulat i en nÄr med hjälp av en mikropipett samtidigt noga musens andningsfrekvensen. Låt musen vila i denna position i 2-5 min efter intranasal infektion för att underlätta nedfallet av jästen i djurets lungor (Figur 3F).
- Efter att musen har smittats, hålla musen i ett övervakat, varm miljö (temperatur mellan 25 och 37 ° C), försiktigt använda en värmelampa om nödvändigt, tills den återhämtar sig från narkosen. När musen vaknar, returnera den till en ren bur med ad lib tillgång till mat och vatten. Burarna är tillbaka till våra djur anläggning och förvaras i en ren djur rum (BLSI).
6. Överlevnad Studier
- Bedöm infekterade och mock-smittade djur kliniskt för takypné, slöhet, slöhet och viktminskning. Djuren bör kontrolleras två gånger dagligen genom laboratorie-medlemmar och dagligen av Skötaren.
- Med murina histoplasmos, tills nära livets slut, det finns vanligtvis inga uppenbara tecken på infektion annat än en mild ökning av andningsfrekvensen. Med avancerad sjukdom, som vanligtvis händer från 10-11 dagar, mössen blivit betydligt tachypneic och har minskad aktivitet. Vanligtvis blir de snabbt döende och löpa ut.
- Bedrövad djur bör avlivas på lämpligt sätt med CO 2 i en särskild kammare bör Avliden djuren räknas dagligen.
7. CFU Studier, histologi och cytokiner Studier
- Förbered 15 ml koniska rör med 10 mL PBS för varje kroppsdel som skall samlas in.
- Euthanize djur 7 och 14 dagar efter infektion med en subletala inuculum (5,0 x 10 6) som tidigare visat och ta bort lunga, mjälte och lever omedelbart.
- Ta bort en bit av den kroppsdel som skall utvärderas och utföra fixering i formalin över natten. Sektionerna kommer att granskas under mikroskop för patologiska utvärdering.
- Förbered 50 ml koniska rör med 5 ml PBS toppad med 70 ìm cell silar för varje organ skall homogeniseras. Upplösta varje återstående delen av organen separat i 50 ml rör med steril kolvar 5 ml spruta.
- Nästa serie späd orgel homogenat (1:100, 1:1000 och 1:5000) och 100μL tallrik varje utspädning på BHI-blod agarplattor (2).
- Lägg tabletter proteashämmare till homogenat enligt tillverka anvisningar (Roche, Tyskland).
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i upp till 14 dagar och räkna CFUs.
- Centrifugera orgeln homogenat på 4000xg i 10 min och ta bort orgel supernatanter kommer önska sig att användas i användas i cytokin-analyser utförs av standardmetoder enligt tillverkaren.
8. Monoklonal antikropp Skydd mot H. Capsulatum är beroende Antikroppspecificitet och isotyp
- MAb isotyp är avgörande för skyddet mot H. capsulatum, som möss som behandlats med IgG1 eller IgG2a MAbs att Hsp60 har betydligt förlängd överlevnad jämfört med kontroll möss som fick en IgG2b mAb till Hsp60 eller antingen en isotypisk kontroll mAb eller PBS (Figur 4).
- Vidare hos möss som fick skyddande MAbs fanns en signifikant minskning av antalet lung-och mjälten CFU på dag 7 och minskningar av 2 och 2,5 log enheter av jäst nummer i lungorna vid dag 14 (Figur 5).
Figur 1: Tillväxt av H. capsulatum och hybridomceller. (A) Likvida HAM F-12 kulturen förberedelse från en enda koloni från H. capsulatum odlas på en BHI-blod agarplattor. (B) Hybridoma tillväxt i behållare cellkultur och mAb rening av protein A / G plast med hjälp av samhörighet cromatography.
Figur 2: H. capsulatum inokulum förberedelse för intranasal infektion. Cellsuspension erhållits efter H. capsulatum aggregat störningar genom sprutan och centrifugering är uppräknade genom att räkna i en hemocytometer. Cellkoncentrationen justeras till 1,25 x 10 7 (överlevnad experiment) eller 5 x 10 6 (CFUs, cytokiner och histologi) hos <50 mikroliter.
upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Figur 3: Mus hantering vid mAb administration. (A) Musen plockas upp i svansen och (B och C) immobiliserade genom att hålla i nackskinnet av sin hals så nära theears. (D) Svansen hålls mellan lillfinger och handflata. (E) mAb Lösningen injiceras med en 26G1 / 2 st. (F) H. capsulatum inokulatet administreras intranasalt genom att försiktigt pipettera cellsuspensionen i en nÄr.
Figur 4: MAbs att Hsp60 kan ändra patogenesen av histoplasmos. ip injektioner med 500 mikrogram av IgG1, eller IgG2a MAbs 2 timmar före infektion signifikant förlängd överlevnad (p <0,05, jämfört med kontroller), men en IgG2b MAB.
Figur 5: CFU bestämningar i lungorna vid 7 och 14 dagar efter en subletala intranasal utmaning med 5x10 6 Hc jästsvampar av möss som behandlats ip med utvalda MAbs att Hsp60 eller irrelevanta mAb visade minskning av svamp börda för IgG1 och IgG2a MAbs behandlade djur. Svarta fält representerar CFUs på dag 7 och vita staplar 14 dagar efter infektion (* p <0,001 vid 7 dagar och ** p <0,001 vid 14 dagar efter infektion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här visar att MAB till H. capsulatum kan ändra loppet av experimentella murina histoplasmos. MAbs till antigener på cellytan av patogener kan ändra den komplicerade dynamiken som uppstår under samspelet mellan värd och patogen. Denna studie konstaterar att MAbs medla skydd i en mus modell av dödliga histoplasmos när det injiceras intraperitonealt, och det antyder kandidat proteiner för utvecklingen av vaccin, såsom H2B, M antigen (yta katalas) (3) och Hsp60. In vivo minskad tillförsel av skyddande MAbs till HC Hsp60 och H2B orgel svamp börda och inflammation och förlängd överlevnad av infekterade möss.
Även utveckling av vaccin för H. capsulatum är ett spännande forskningsområde, kan vaccination vara effektiv med nedsatt immunförsvar, eftersom de inte nödvändigtvis iscensätta en immunoresponse. Därför är det tydligt att denna population kan dra mest från passiv behandling med mAb till H. capsulatum antigener. Våra data tyder på att MAbs, särskilt till Hsp60 eller i kombination med andra MAbs till cell ytantigener, skulle kunna förbättra behandlingen av patienter med histoplasmos (4, 6). Dessutom kombination av en mAb till H. capsulatum med antimykotisk medicinering kan vara samverkande och effektivare i skyddande effekt. Amfotericin B är en populär drog och vanligtvis används för initial behandling av histoplasmos. Därför bör tillägg av mAb till antimykotisk medicinering övervägas i framtida studier. I själva verket har vi visat tidigare har en synergistisk effekt av MAbs till H2B och sub-hämmande koncentrationer av amfotericin B i vår djurmodell (5). Dessutom kan MAbs ges profylaktiskt vid utbrott av histoplasmos, särskilt till högriskindivider, såsom individer med humant immunbristvirus infektion eller patienter som får TNF-α hämmare. Framtida utredningar av skyddande mAb kan leda till nya viktiga insikter i patogenesen av histoplasmos och antikroppar funktion mot H. capsulatum och kanske andra intracellulära patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
