Summary
Camundongos C57BL / 6 foram usados para estudar a patogênese Hc e fornecer o melhor modelo. Estamos explorando os benefícios potenciais da imunidade humoral contra este fungo e gerou várias mAbs [a histona H2B e um calor 60kDa proteína de choque] que testamos para sua eficácia protectora após a administração intraperitoneal.
Abstract
O objetivo do uso desta metodologia é 1) para avançar a nossa capacidade de proteger os indivíduos com anticorpo ou vacina para prevenir ou tratar histoplasmose causada pelo fungo Histoplasma capsulatum e 2) para examinar o papel de fatores de virulência como alvo para a terapia. Para gerar mAbs, os camundongos são imunizados, as respostas imunes são avaliados através de um sistema de ELISA em fase sólida desenvolvido em nosso laboratório, ea melhor resposta ratos são selecionados para isolamento de esplenócitos para a fusão com células de hibridoma. Camundongos C57BL / 6 têm sido amplamente utilizados para estudar H. patogênese capsulatum e fornecer o melhor modelo para a obtenção dos dados necessários. A fim de avaliar o papel do mAbs em infecção, os ratos são administrados por via intraperitoneal com um mAb para H. capsulatum ou combinados isotipo controle mAb e infectados por um ou outro intravenosa (iv), intraperitoneal (ip), ou intranasal (in) rotas. Na literatura científica, a eficácia de mAbs para infecções fúngicas em camundongos depende de mortalidade como um ponto final, em conjunto com unidades formadoras de colónias formin (CFU) avaliações em momentos anteriores. Sobrevida (tempo de morte) são necessários estudos em que melhor representam a doença humana. Assim, a eficácia da nossa intervenção não ser adequadamente estabelecida sem curvas de sobrevivência. Isto também é verdade para estabelecer a eficácia da vacina ou teste de mutantes para a virulência. Com histoplasmose, os ratos vão frequentemente de ser energético para mortos durante várias horas. A capacidade de uma intervenção como a administração de um mAb podem, inicialmente, proteger um animal de doença, mas a doença pode recaída que não seria realizado em experimentos de curta UFC. Além de sobrevivência e ensaios de carga fúngica, examinamos as respostas inflamatórias à infecção (histologia, recrutamento celular, as respostas de citocinas). Para a sobrevivência / hora para experiências de morte, os camundongos são infectados e monitoradas pelo menos duas vezes por dia para sinais de morbidade. Para avaliar a carga fúngica, histopatologia, e as respostas de citocinas, os ratos são sacrificados em vários momentos após a infecção. Experiências com animais são realizadas de acordo com as diretrizes do Instituto de Estudos Animal do Albert Einstein College of Medicine.
Protocol
1. Crescimento de H. Capsulatum
- Prepare um gabinete de biossegurança para o trabalho com o fungo com a limpeza do gabinete com lixívia a 10%, seguido por 20 min de irradiação UV. H. capsulatum na fase leveduriforme Biossegurança exige nível práticas (BSL) II, enquanto a forma de moldes requer BSLIII. Use o formulário de leveduras nas etapas seguintes.
- Em seguida preparar um tubo cônico de 15 ml com 5 ml de PBS. Colheita uma colônia de H. capsulatum (linhagem ATCC Hc G217B) de uma placa de agar sangue BHI [glicose a 10 g / L, cisteína 0,1 g / L, a penicilina-estreptomicina 1% e os carneiros células vermelhas do sangue 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, EUA) ] cultivadas a 37 ° C ou tomar uma alíquota do estoque de fermento congelado a -80 ° C e adicioná-lo à PBS. Vortex vigorosamente as células e centrifugar para 1100 xg por 10 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 10ml de PBS fresco. Repita este procedimento três vezes. Suspender as células em 5 mL de PBS e tranfer para um tubo cônico de 50 mL.
- Para perturbar as células agregadas, passe a suspensão de células de levedura por meio de um G1 26 / 2 agulha u cantar uma seringa de 10 mL 5 vezes em uma cabine de segurança biológica (usando proteção facial). Para isolar o fermento, pequeno de tamanho uniforme, centrifugar as células a 55 xg por 1 min em temperatura ambiente e depois remover o top 1 ml.
- Adicione a suspensão celular para um erlenmeyer estéril, contendo 100 ml de meio HAM F12 (GIBCO) suplementado com 16g / L de glicose, 1 g / L de ácido glutâmico, 8.4mg / L cistina, 6g / L de ácido glutâmico e, em seguida, as células crescem a 37 ° C por 48 h em uma incubadora com agitação 150rpm.
2. Hibridoma Crescimento e Purificação de anticorpos monoclonais
- Transferir os hibridomas selecionados para DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, NCTC 10%, 1% não-aminoácidos essenciais e 1% penicilina-estreptomicina. Cultivar as células em um frasco de cultura de células (Becton Dickinson) por 5-7 dias a 37 ° CO C / 5% 2.
- Em seguida, centrifugar a média em 1100 xg por 10 min à temperatura ambiente e recolher todas as sobrenadante sem perturbar as pelotas.
- Em seguida, purificar o sobrenadante livre de células usando uma proteína A / G resina por FPLC.
- A concentração mAb pode então ser calculada por um ELISA de captura (1) usando um controle de isotipo IgG como padrão (Figura 1B).
3. Preparação do inóculo Histoplasma capsulatum
- Dê uma 48 h Histoplasma capsulatum (Hc estirpe ATCC G217B) cultura fase de levedura cultivada em meio HAM F-12.
- Centrifugar as células a 1100 xg por 10 min. Desprezar o sobrenadante e adicionar PBS fresco.
- Repita o procedimento 3 vezes 3,2.
- Passe a suspensão de células de levedura 5 vezes através de uma agulha 26G1 / 2, utilizando uma seringa.
- Centrifugar a suspensão a 55 xg por 1 min a clusters pellet celular residual. Transferir o sobrenadante contendo a suspensão única célula para um novo tubo.
- Enumerar a suspensão de células usando uma única hematocytometer.
- Ajustar a concentração de células, a fim de atingir 1,25 x 10 7 levedura (sobrevivência) ou 5,0 x 10 6 (CFU, citocinas e histologia) em um Suspenção de <mL 50 (Figura 2).
4. Administração intraperitoneal da MAbs
- Pegar o rato pelo rabo e da nuca do pescoço (Fig. 3A). Imobilizar o mouse pela nuca de seu pescoço tão perto theears possível (certifique-se de assumir a pele suficiente para que o mouse cannotturn sua cabeça para morder a pessoa manuseá-lo; Figura 3B e 3C).
- Estabilizar o dedo withthe rabinho suavemente pressionado contra a palma da mão (Figura 3D).
- Swab a zona da injecção com etanol 70% antes de colocar a agulha e para aspirar a olhar para o sangue antes de injetar.
- Use o 26G1 / 2 a piercethe pele e abdominalmuscles para injectar a solução mAb contendo 500μg (PBS, isotipo de anticorpo de controle ou o mAb a serem testadas, diluídas em 1 mL PBS) em esquerda thelower ou quadrante inferior direito abdominal (cavidade intraperitoneal), com o animal na cabeça para baixo, tomando cuidado para evitar os órgãos internos andother diafragma (Figura 3E).
- Esperar um pouco antes de retirar o needleto reduzir a probabilidade de vazamentos.
- Espere um mínimo de duas horas antes de prosseguir para a próxima etapa.
5. Anestesia do mouse e Infecções intranasal
- Prepare a anestesia com ketamina e xilazina a 100 mg / Kg e 10 mg / Kg, respectivamente. Executar a administração intraperitoneal de PBS, isotipo de anticorpo controle, ou anticorpos experimental, conforme descrito no protocolo escrito que o acompanha. Esperar duas horas após a injeção de mAb antes de anestesiar o rato e prosseguir com a infecção intranasal.
Prepare anestesia com quetamina e xilazina a 100 mg / Kg e 10 mg / kg, respectivamente (7). - Durante o período de 2h de espera, prepare o inóculo capsulum Histoplasma, conforme descrito no protocolo escrito que o acompanha.
- Proceder de acordo com os itens 5,1-5,5. Toe pitada os animais com uma pinça e verificar a ausência de reflexo e confirmam que a anestesia funcionou. Anaesthetization Depois, gentilmente suspender o mouse por seus dentes da frente a uma corda de nylon ou algodão. Use 2 está coluna para amarrar as cordas, a fim de suspender os animais.
- Lentamente administrar cerca de 50 mL de inóculo em um nare usando uma micropipeta, enquanto monitorando de perto a taxa de rato respiração. Permitir que o mouse para descansar nesta posição por 2-5 min após a infecção intranasal para facilitar a deposição da levedura nos pulmões do animal (Figura 3F).
- Depois de o rato tenha sido infectado, manter o mouse em um ambiente monitorado quente (temperatura entre 25 e 37 ° C), com cuidado, utilizando uma lâmpada de calor, se necessário, até que ele se recupera da anestesia. Quando o desperta mouse, devolvê-lo para uma gaiola limpa, com acesso ad libitum à água e comida. As gaiolas são devolvidos para as nossas instalações de animais e mantidos em uma sala de animal limpo (BLSI).
6. Estudos de sobrevivência
- Avaliar os animais infectados e mock-infectados clinicamente por taquipnéia, letargia, obnubilação e perda de peso. Os animais devem ser verificados duas vezes por dia por membros de laboratório e diariamente por guardas Animal.
- Com histoplasmose murina, até perto do fim da vida, normalmente há nenhum sinal aparente de infecção que não seja um ligeiro aumento da taxa de respiração. Com doença avançada, o que geralmente acontece a partir de 10-11 dias, os ratos tornaram-se significativamente taquipnéicos e têm atividade diminuída. Normalmente, eles rapidamente se tornam moribunda e expirar.
- Afligido animais devem ser sacrificados de forma adequada com CO 2 em uma câmara dedicada, falecido animais devem ser enumeradas diária.
7. Estudos Estudos CFU Histologia e Citocinas
- Prepare 15 ml tubos cônicos de 10 mL com PBS para cada órgão a ser coletado.
- Euthanize animais 7 e 14 dias após a infecção com um inuculum subletais (5,0 x 10 6), como demonstrado anteriormente e remover o baço, pulmão e fígado imediatamente.
- Remover um pedaço do órgão a ser avaliado e realizar a fixação em formol durante a noite. As seções serão examinadas sob o microscópio para avaliação patológica.
- Prepare 50 ml tubos cônicos com PBS 5 mL coberto com 70 filtros de células mm para cada órgão a ser homogeneizados. Macerar cada parcela restante dos órgãos, separadamente para os 50 mL utilizando tubos êmbolos seringa estéril 5mL.
- Em seguida, em série diluir homogeneizados de órgãos (1:100, 1:1000 e 1:5000) e 100μL placa de cada diluição em placas BHI-ágar sangue (2).
- Adicionar comprimidos de inibidor de protease para o homogeneizados de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha).
- Incubar as placas a 37 ° C por até 14 dias e UFC enumerar.
- Centrifugar a homogeneizados de órgãos em 4000xg por 10 min e retire sobrenadantes órgão, whish será usado em usados nos ensaios de citocinas realizada por métodos padronizados de acordo com o fabricante.
8. Proteção anticorpo monoclonal contra H. Capsulatum é dependente e Especificidade de Anticorpos do isotipo
- O mAb isotipo é fundamental na proteção contra H. capsulatum, como camundongos tratados com IgG1 ou IgG2a mAbs a Hsp60 têm sobrevida significativamente prolongada em comparação com camundongos controle recebendo um mAb IgG2b a Hsp60 ou seja um isotipo controle mAb ou PBS (Figura 4).
- Além disso, em camundongos que receberam anticorpos monoclonais de proteção, houve uma redução significativa no número de CFU pulmonar e esplênica no dia 7 e diminui de 2 e 2,5 unidades log de números de levedura nos pulmões no dia 14 (Figura 5).
Figura 1: Crescimento do H. capsulatum e hibridomas. (A) preparação líquida HAM F-12 cultura a partir de uma única colônia obtida H. capsulatum cultivadas em placas de BHI ágar-sangue. (B) o crescimento Hibridoma em frascos de cultura de células e purificação mAb pela proteína A / G resina cromatografia de afinidade usando.
Figura 2: H. capsulatum preparação do inóculo para a infecção intranasal. Suspensão de células obtidas após H. interrupção agregados capsulatum por seringa e centrifugação é enumerado pela contagem em um hemocitômetro. Concentração de células é ajustado para 1,25 x 10 7 (experimentos de sobrevivência) ou 5 x 10 6 (UFC, citocinas e histologia) em <mL 50.
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Figura 3: manuseio do mouse durante mAb administração. (A) O mouse é pego pelo rabo e (B e C) imobilizada segurando a nuca de seu pescoço tão perto theears. (D) A cauda é realizada entre o dedo mindinho e na palma. (E) A solução mAb é injetado com uma agulha 26G1 / 2. (F) O H. capsulatum inóculo é administrada por via intranasal com cuidado pipetando suspensão de células em um nare.
Figura 4: MAbs a Hsp60 pode alterar a patogênese da histoplasmose. injeções ip com 500 mg de IgG1, IgG2a mAbs ou 2 h antes para a sobrevivência de infecção significativamente prolongada (p <0,05, em comparação com controles), mas um IgG2b mAb.
Figura 5: determinações CFU nos pulmões, 7 e 14 dias após um desafio subletais intranasal com 5x10 6 leveduras Hc de camundongos tratados com ip mAbs selecionados para Hsp60 ou mAb irrelevante mostrou redução na carga fúngica para IgG1 e IgG2a mAbs animais tratados. Barras pretas representam UFC no dia 7 e barras brancas 14 dias pós-infecção (* p <0,001 em 7 dias e ** p <0,001 em 14 dias após a infecção).
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Discussion
O protocolo aqui apresentado demonstra que mAb de H. capsulatum pode modificar o curso de histoplasmose murina experimental. MAbs aos antígenos de superfície celular de patógenos pode modificar a dinâmica complexa que ocorrem durante a interação entre um host e um patógeno. Este estudo estabelece que mAbs mediar proteção em um modelo murino de histoplasmose letal quando injetada por via intraperitoneal, e sugere proteínas candidato para o desenvolvimento de vacinas, como H2B, M antígeno (superfície catalase) (3) e Hsp60. In vivo, a administração de mAbs de proteção para Hc Hsp60 e H2B órgão reduziu a carga de fungos e inflamação e sobrevivência prolongada de camundongos infectados.
Embora o desenvolvimento de vacinas para a H. capsulatum é uma área interessante de pesquisa, a vacinação não pode ser eficaz em indivíduos imunodeprimidos, já que não podem necessariamente orquestrar uma resposta imune. Por isso, é claro que esta população pode beneficiar principalmente a partir de terapia passiva com mAb para H. antígenos capsulatum. Nossos dados sugerem que mAbs, especialmente para Hsp60 ou em combinação com outros mAbs aos antígenos de superfície celular, poderiam melhorar o tratamento de pacientes com histoplasmose (4, 6). Além disso, combinação de um mAb para H. capsulatum com a terapia de drogas antifúngicas podem ser sinérgicos e mais eficaz na eficácia protectora. Anfotericina B é a droga de escolha e, geralmente, utilizados para o tratamento inicial de histoplasmose. Assim, a adição de mAb à terapia medicamentosa antifúngico deve ser considerado em estudos futuros. Na verdade, nós já demonstraram um efeito sinérgico de mAbs para H2B e sub-inibitória concentrações de anfotericina B em nosso modelo animal (5). Além disso, mAbs poderia ser administrado profilaticamente em surtos de histoplasmose, especialmente para indivíduos de alto risco, tais como indivíduos com infecção pelo vírus da imunodeficiência humana ou pacientes que receberam TNF-α inibidores. Investigações futuras de proteção mAb pode revelar outros importantes insights sobre a patogênese da histoplasmose e função de anticorpos contra o H. capsulatum e, talvez, outros patógenos intracelulares.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
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