Summary
C57BL / 6小鼠已被用于研究HC发病机制，并提供最好的模式。我们正在探索这种真菌对体液免疫的潜在利益，并产生了几个单克隆抗体[组蛋白H2B和热休克蛋白60kDa]，我们为他们的腹腔给药后的保护效果测试。
Abstract
使用这种方法的目的是1），以推进我们的能力，以保护个人与抗体或疫苗，以防止或治疗由真菌组织胞浆菌和2）审查致病因素的作用，为治疗目标引起的组织胞浆菌病。产生单克隆抗体，免疫小鼠的免疫反应是采用固相酶联免疫吸附在我们的实验室开发的系统进行评估，并选择隔离的脾细胞与杂交瘤细胞融合的最好的响应者小鼠。 C57BL / 6小鼠已被广泛用于研究H。 capsulatum的发病机制，并提供获得所需的数据的最佳模式。为了评估在感染的单克隆抗体的作用，小鼠腹腔要么单抗管理到 H capsulatum或亚型匹配控制单克隆抗体，然后感染要么静脉（IV），腹腔（IP），或滴鼻（中）路线。在科学文献中，单克隆抗体在小鼠体内的真菌感染疗效依赖对死亡率作为终点，在殖民地成蛋白单位（CFU）在较早的时间点评估一起。生存（死亡时间）的研究是必要的，因为他们最能代表人类疾病。因此，我们干预的疗效不会充分地建立无生存曲线。这也是真正建立疫苗疗效或毒力突变体的测试。随着组织胞浆菌病，老鼠经常去充满活力，以死了几个小时。最初可能会干预，如管理一个MAB能力保护的动物疾病，但疾病的复发这不会在短期CFU实验实现。除了生存和真菌的负担分析，我们考察感染（蜂窝招聘，组织学，细胞因子反应）的炎症反应。生存/死亡实验，小鼠被感染，至少每天两次监测发病的迹象。为了评估真菌的负担，组织病理学和细胞因子的反应，小鼠在感染后的不同时期，实施安乐死。根据阿尔伯特爱因斯坦医学院的动物实验研究所的指引，进行动物实验。
Protocol
1。生长的H. Capsulatum
- 与真菌的工作准备了一个生物安全内阁，内阁由20分钟的紫外线照射10％的漂白粉清洗。H.在酵母阶段的 capsulatum 需要生物安全水平（BSL）二做法，而模具的形式要求BSLIII。使用酵母的形式，在下面的步骤。
- 下一步准备用5毫升的PBS 15 ml锥形管。收获了殖民地的H. capsulatum（株HC ATCC G217B）从一个BHI血琼脂平板[葡萄糖10 g / L的半胱氨酸0.1 g / L的，青霉素，链霉素1％绵羊红细胞50毫升/升（科罗拉多州的血清有限公司，科罗拉多州，美国） ]耕地在37 ° C，或采取分装于-80 ° C冷冻酵母股票，并把它添加到的PBS。涡大力细胞和离心机在室温为10分钟为1100 XG。小心取出上清液互不干扰颗粒，并添加10毫升的新鲜PBS。重复这个过程三次。暂停PBS和转院至50 mL锥形管5ML细胞。
- 扰乱聚合的细胞，酵母细胞悬液通过一个26 G1 / 2针ü唱10ml注射器在生物安全柜（使用面部防护）的5倍。为了隔离小，大小均匀的酵母，离心55在室温下1分钟XG的细胞，然后取出1毫升。
- 细胞悬液加入到含有100毫升火腿F12培养基（GIBCO），辅以16克/ L葡萄糖，1g / L的谷氨酸，8.4mg / L的胱氨酸，6克/ L的谷氨酸，然后生长的细胞在37的无菌锥形瓶中° C为48 h，用孵化器150RPM晃动。
2。单克隆抗体的杂交瘤细胞的生长和纯化
- 将选定的杂交瘤细胞DMEM培养基含10％小牛血清，10％NCTC，1％非必需氨基酸和1％的青霉素，链霉素。生长的细胞在细胞培养瓶（流式细胞迪肯森）为5-7天，在37 ° C / 5％的CO 2 。
- 然后离心1100 XG介质，在室温为10分钟和扰乱颗粒的情况下收集上清。
- 接下来，净化的无细胞上清液使用蛋白A / G FPLC树脂。
- 单克隆抗体的浓度，然后可以计算一个捕获ELISA法（1）使用一个作为标准的IgG亚型控制（图1B）。
3， 组织胞浆菌 接种准备
- 以一个48小时的组织胞浆菌（ 株 HC ATCC G217B）酵母阶段文化火腿 架F - 12培养基中生长。
- 离心10分钟在1100 XG的细胞。弃去上清，加入新鲜的PBS。
- 重复3.2程序的3倍。
- 通过酵母细胞悬液通过26G1 / 2使用注射器针头的5倍。
- 离心1分钟颗粒残留细胞团在55 XG暂停。上清液中含有的单细胞悬液转移到一个新的管。
- 枚举单细胞悬液，用一个hematocytometer。
- 调整细胞浓度，以达到1.25 × 10 7酵母（生存）或5.0 × 10 6（CFU，细胞因子和组织学）<50μL（图2）suspention。
4。腹腔注射的单克隆抗体
- 拿起鼠标，它的尾巴和颈背（图3A）。固定鼠标，它的脖子颈背接近尽可能theears（确保采取足够的皮肤，使鼠标cannotturn其头部咬经办人;图3B和3C）。
- 稳定的尾巴withthe小指轻轻对手的手掌（图3D）压。
- 擦拭前放置针吸出的血液，注射前用70％乙醇注射区。
- 使用26G1 / 2 piercethe注入单克隆抗体溶液中含有500μg（PBS，同型对照抗体或单克隆抗体进行测试，在1 mL PBS稀释），到thelower左或右下腹部象限（腹腔腔），与皮肤和abdominalmuscles动物头向下的位置，注意避免的隔膜和其它内脏器官（图3E）。
- 简单地等待之前退出的needleto减少泄漏的可能性。
- 等待至少两个小时，然后再继续下一步。
5。鼠标麻醉和鼻内感染
- 准备麻醉在100毫克/公斤和10毫克/公斤，分别使用氯胺酮和甲苯噻嗪。执行的PBS腹腔注射，同型对照抗体，或在所附的书面协议中所述的实验抗体。等待前两个小时后，单克隆抗体注射麻醉鼠标和进行滴鼻感染。
准备使用氯胺酮麻醉在100毫克/公斤和10毫克/公斤，分别为（7）和甲苯噻嗪。 - 在下半年的等待期，准备在所附的书面协议中所述的组织胞浆 capsulum接种。
- 按照itens 5.1至5.5。脚趾捏动物镊子和验证反射的情况下，并确认，麻醉工作 。anaesthetization后，轻轻地暂停其门牙鼠标尼龙或棉线。使用2列站，以配合以暂停动物的字符串。
- 慢慢地管理使用一个微管，同时密切监测鼠标的呼吸速率纳惹约50μL接种。让鼠标在这个位置上，以方便酵母沉积到动物的肺（图3F）休息2-5分钟后，鼻内感染。
- 已感染小鼠后，保持在一个监控，温暖的环境（25和37℃之间的温度）鼠标，仔细利用热灯，如果有必要，直到它从麻醉中复苏。当鼠标醒来时，它返回到一个随意获取食物和水的清洁笼笼返回到我们的动物设施，并保持在一个干净的动物房（ BLSI）。
6。生存研究
- 临床评估的感染和模拟感染的动物，呼吸急促，嗜睡，obtundation和减肥。动物应每天两次检查，实验室成员和动物护理人员每天。
- 小鼠组织胞浆菌病，直到接近生命的尽头，通常是在呼吸率有轻微上升以外的感染没有明显的迹象。凭借先进的疾病，通常发生10-11天，老鼠变得明显tachypneic活动已经减少。通常情况下，他们迅速成为垂死的和过期。
- 仿旧的动物，应适当地与一个专用室中 CO 2安乐死，死去的动物应每天枚举。
7。 CFU学，组织学和细胞因子的研究
- 每个要收集的器官，准备用10ml PBS 15 ml锥形管。
- 如前所示（5.0 × 10 6）与亚致死inuculum安乐死7和动物感染后14天，并立即删除的肺，脾，肝。
- 取下一块进行评估的机构和执行的固定在福尔马林过夜。该路段将显微镜下的病理评价研究。
- 准备用5ml PBS 50 ml锥形管超过70微米的细胞过滤器，为每个要匀浆器官。浸渍每个机关的剩余部分，分别到50毫升管使用无菌5ml注射器活塞。
- 接下来，连续稀释器官匀浆液（1:100，1:1000和1:5000）BHI血琼脂平板（2），每个稀释度的板100μL。
- 根据制造商的指示（罗氏公司，德国）的匀浆加入蛋白酶抑制剂药片。
- 孵育板在37 ° C为14天，并列举CFUs。
- 4000xg器官组织匀浆离心10分钟，取出器官上清，哗哗将用于在根据制造商的标准方法进行因子分析。
8。对H.单克隆抗体保护Capsulatum是依赖抗体的特异性和抗体同种型
- 单克隆抗体亚型是对阁下保护的关键capsulatum，以HSP60与IgG1的或IgG2a单克隆抗体治疗的小鼠的生存期明显延长，与对照组比较小鼠收到IgG2b单克隆抗体HSP60亚型控制人与生物圈计划或PBS（图4）。
- 此外，收到保护的单克隆抗体在小鼠，在7天的肺和脾的CFU数量显着减少，减少酵母数为2和2.5个对数单位在第14天（图5）肺。
图1：H 的增长capsulatum和杂交瘤细胞。 （a）液体火腿的F - 12的文化准备从H.获得单菌落capsulatum一个BHI血琼脂平板上生长。 （二）细胞培养瓶和单克隆抗体纯化蛋白A / G的树脂使用的亲和力cromatography的杂交瘤细胞增长。
图2：H capsulatum滴鼻感染接种的准备。后， 阁下获得的细胞悬液注射器和离心中断capsulatum聚集在血球计数枚举。细胞浓度调整为1.25 × 10 7（生存实验）或5 × 10 6 <50μL（CFUs，细胞因子和组织学） 。
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图3：鼠标在单克隆抗体的行政处理。 （一）拿起鼠标的尾巴（B和C），由它的脖子颈背尽量接近，以theears固定。 （四）尾是小指和手掌之间举行。 （五）单克隆抗体的解决方案是使用26G1 / 2针注射。 （F）的H. capsulatum接种管理滴鼻，轻轻吹打成一个纳惹细胞悬液。
图4：以HSP60单克隆抗体可以改变组织胞浆菌病的发病机制。 IP注射500微克的IgG1的，或IgG2a单克隆抗体2小时前感染的生存期明显延长（P <0.05，与对照组相比），但一个IgG2b单克隆抗体。
图5：CFU测定肺部在7和14天，后一个亚致死5X10 6 HC小鼠酵母菌治疗用单克隆抗体，以HSP60或不相关的单克隆抗体显示为IgG1的和IgG2a减少真菌的负担，单克隆抗体治疗的动物的IP鼻内挑战。黑条代表在第7天CFUs和白条感染后14天（* P <0.001 7天，** P <0.001），在感染后14天。
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Discussion
这里介绍的协议表明，单克隆抗体的到 H capsulatum可以修改实验小鼠组织胞浆菌病的过程中。病原菌的细胞表面抗原的单克隆抗体可以修改主机和病原体之间的相互作用过程中发生的复杂的动态。这项研究建立了单克隆抗体介导腹腔注射时的一个致命性组织胞浆菌病的小鼠模型的保护，并建议候选蛋白疫苗的开发，如H2B，中号抗原（表面过氧化氢酶）（3）和HSP60。管理HC HSP60和H2B保护单克隆抗体在体内，减少器官的真菌负担和炎症和感染小鼠的生存时间延长。
虽然疫苗发展为H。 capsulatum是一个令人兴奋的研究领域，接种疫苗可能无法有效的免疫力受损的人，因为他们不一定能够协调一个免疫反应。因此，很显然，这部分人口可能主要受益于与人与生物圈计划的被动治疗到 H capsulatum抗原 。我们的数据表明，单克隆抗体，尤其是HSP60或与其他单克隆抗体结合到细胞表面抗原，可提高患者的治疗与组织胞浆菌病（4，6）。此外，一个单克隆抗体结合到 H capsulatum抗真菌药物治疗，可以协同和更有效地保护效果。两性霉素B是首选药物，通常用于组织胞浆菌病的初始治疗。因此，除了抗真菌药物治疗的单克隆抗体，应考虑在今后的研究中。事实上，我们先前已经展示了H2B，在我们的动物模型（5）两性霉素B亚抑菌浓度的单克隆抗体的协同效应。此外，单克隆抗体可预防管理组织胞浆菌病的爆发，特别是高风险的个人，如人类免疫缺陷病毒感染或TNF -α抑制剂的患者在接受个人，。单克隆抗体的保护将来的调查可能对H.抗体功能和组织胞浆菌病的发病增加了重要的见解，揭示capsulatum，也许还有其他细胞内的病原体。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
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