Summary
وقد استخدمت C57BL / 6 الفئران لدراسة HC المرضية وتقديم النموذج الأفضل. نحن استكشاف الفوائد المحتملة للمناعة ضد هذا الفطر الخلطية ولدت MABS عدة [لH2B هيستون والصدمة الحرارية من البروتين 60kDa] أننا لاختبار فعاليتها وقائية بعد تعاطيه في التجويف الجنبي.
Abstract
الغرض من استخدام هذه المنهجية هو 1) لتعزيز قدرتنا على حماية الأفراد مع الأجسام المضادة أو لقاح لمنع أو علاج المنسجات التي يسببها فطر النوسجة المغمدة و 2) لدراسة دور العوامل الفوعة هدفا للعلاج. لتوليد MABS ، وتحصين الفئران ، وتقييم الاستجابات المناعية باستخدام نظام متين ELISA المرحلة المتقدمة في المختبر لدينا ، ويتم اختيار أفضل الفئران المستجيب لعزل splenocytes للاندماج مع خلايا ورم هجين. وقد C57BL / 6 الفئران المستخدمة على نطاق واسع لدراسة H. المغمدة المرضية وتقديم أفضل نموذج للحصول على البيانات المطلوبة. من أجل تقييم دور MABS في العدوى ، والفئران هي intraperitoneally تدار إما مع خريطة موقع لحاء المغمدة isotype المتطابقة أو خريطة موقع السيطرة وأصاب بعد ذلك إما عن طريق الوريد (IV) ، والطرق (في) داخل الصفاق (IP) ، أو الأنف. في الأدبيات العلمية ، وفعالية MABS للالتهابات فطرية في الفئران تعتمد على وفيات ونقطة نهاية ، بالاشتراك مع وحدات formin مستعمرة (CFU) المقررة في نقاط وقت سابق. البقاء على قيد الحياة (وقت الوفاة) دراسات ضرورية لأنها تمثل أفضل الأمراض التي تصيب البشر. وبالتالي ، فإن فعالية تدخلنا ليس كافيا أن تنشأ من دون منحنيات البقاء على قيد الحياة. هذا ينطبق أيضا على إقامة فعالية لقاح أو اختبار الفوعة عن المسوخ. مع المنسجات ، وغالبا ما تذهب من الفئران التي يجري نشطة لطريق مسدود بسبب عدة ساعات. قد قدرة تدخل مثل إدارة حماية من خريطة موقع مبدئيا على الحيوان من المرض ، ولكن يمكن انتكاس المرض الذي لن يتحقق في التجارب CFU قصيرة. بالإضافة إلى بقاء والمقايسات عبء الفطرية وندرس الاستجابات الالتهابية للعدوى (الأنسجة ، والتوظيف الخلوية ، والاستجابات خلوى). من أجل البقاء / زمن لتجارب الموت ، وإصابة الفئران ورصد ما لا يقل عن مرتين يوميا بحثا عن علامات لاعتلال. لتقييم عبء الفطرية والأنسجة ، والاستجابات خلوى ، يصرح باستخدامها الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى. وتجرى التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمعهد الدراسات الحيوانية في كلية ألبرت اينشتاين للطب.
Protocol
1. نمو H. المغمدة
- يعد مجلس الوزراء السلامة الحيوية للعمل مع الفطريات عن طريق تنظيف مجلس الوزراء مع التبييض 10 ٪ ، تليها 20 دقيقة للاشعة فوق البنفسجية. ه. المغمدة في المرحلة الخميرة يتطلب مستوى السلامة (BSL) الممارسات الثاني ، في حين شكل القالب يتطلب BSLIII. استخدام نموذج الخميرة في الخطوات التالية.
- إعداد المقبل أنبوب 15 مل المخروطية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. حصاد مستعمرة H. المغمدة (سلالة اتش سي آي تي سي سي G217B) من لوحة بهي آغار الدم [الجلوكوز 10 جم / لتر ، السيستين 0.1 غ / لتر ، البنسلين الستربتوميسين 1 ٪ والغنم خلايا الدم الحمراء 50 مل / لتر (كولورادو شركة المصل ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ] المزروعة في 37 درجة مئوية أو اتخاذ قسامة من المخزون الخميرة المجمدة عند درجة -80 وإضافته إلى برنامج تلفزيوني. دوامة الخلايا بقوة والطرد المركزي ل1100 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 10ML من برنامج تلفزيوني جديد. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات. تعليق الخلايا في 5mL من برنامج تلفزيوني وtranfer لأنبوب مخروطي 50 مل.
- لتعطيل الخلايا مجمعة ، تمرير تعليق خلية الخميرة من خلال G1 26 / 2 ش الغناء إبرة حقنة 10ML 5 مرات في خزانة السلامة البيولوجية (باستخدام حماية الوجه). لعزل صغيرة خميرة موحد الحجم ، الطرد المركزي الخلايا في 55 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الجزء العلوي 1 مل.
- إضافة تعليق إلى خلية دورق مخروطي العقيمة التي تحتوي على 100 مل من المتوسط F12 HAM (GIBCO) تستكمل مع 16G / L الجلوكوز ، 1G / L حمض الجلوتاميك ، سيستين 8.4mg / L ، 6G / L حمض الجلوتاميك ثم تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في حاضنة مع 150rpm تهتز.
2. ورم هجين النمو وتنقية الاجسام المضادة
- نقل hybridomas المحدد إلى المتوسطة DMEM تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ، NCTC 10 ٪ ، 1 ٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية ، و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين. تنمو الخلايا في خلية قارورة الثقافة (بيكتون ديكنسون) لمدة 5-7 أيام في 37 ° C CO / 5 ٪ 2.
- الطرد المركزي ثم المتوسطة في 1100 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وجمع كل طاف دون تعطيل الكريات.
- المقبل ، تنقية طاف الخلية الحرة باستخدام بروتين والراتنج / G بواسطة FPLC.
- ويمكن بعد ذلك تركيز خريطة موقع يحسب بواسطة ELISA القبض على (1) باستخدام عنصر تحكم isotype مفتش الحكومة وفقا لمعايير (1B الشكل).
3. قيحة النوسجة المغمدة التحضير
- تأخذ 48 ساعة النوسجة المغمدة المرحلة الخميرة (سلالة اتش سي آي تي سي سي G217B) ثقافة نمت في المتوسط F - 12 HAM.
- الطرد المركزي الخلايا في 1100 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وإضافة برنامج تلفزيوني جديد.
- كرر الإجراء 3.2 3 مرات.
- تمرير تعليق خلية الخميرة 5 مرات من خلال إبرة 26G1 / 2 باستخدام حقنة.
- تعليق الطرد المركزي في 55 XG ل1 دقيقة لكتل بيليه الخلية المتبقية. نقل طاف يحتوي على تعليق خلية واحدة لأنبوب جديد.
- تعداد تعليق خلية واحدة باستخدام عدادة الكريات.
- ضبط تركيز الخلية من أجل تحقيق 1.25 × 10 7 الخميرة (البقاء) أو 5.0 × 10 6 (CFU ، السيتوكينات والأنسجة) في suspention ميكرولتر من 50 <(الشكل 2).
4. داخل الصفاق الإدارة التابعة للMABS
- التقاط الماوس بواسطة ذيله والقفا من الرقبة (الشكل 3A). لشل حركة الماوس من القفا من عنقه في أقرب وقت ممكن إلى theears (تأكد من تناول الجلد بما فيه الكفاية بحيث الماوس cannotturn رئيسها لدغة الشخص التعامل مع الامر ، والشكل 3B 3C).
- استقرار إصبع withthe الذيل قليلا الضغط بلطف على كف اليد (الشكل 3D).
- المسحة منطقة حقن الإيثانول مع 70 ٪ قبل وضع الإبرة ، ونضح الدم للبحث عن طريق الحقن قبل.
- استخدام 26G1 / 2 إلى piercethe الجلد وabdominalmuscles لحقن محلول يحتوي على خريطة موقع 500μg (PBS ، isotype الضد أو السيطرة على خريطة موقع لفحصها ، مخففة في برنامج تلفزيوني مل 1) إلى اليسار أو أقل thelower رباعي الحق في البطن (تجويف داخل الصفاق) ، مع الحيوان في رأسه لأسفل الموقف ، مع الحرص على تفادي أجهزة andother غشاء الداخلي (الشكل 3E).
- الانتظار لفترة وجيزة قبل سحب needleto يقلل من احتمالات التسرب.
- الانتظار مدة لا تقل عن ساعتين قبل الشروع في الخطوة التالية.
5. التخدير الماوس والتهابات الأنف
- إعداد باستخدام التخدير والكيتامين زيلازين عند 100 ملغ / كلغ و 10 ملغ / كلغ على التوالي. أداء الإدارة داخل الصفاق من برنامج تلفزيوني ، isotype الضد السيطرة ، أو الضد التجريبية كما هو موضح في البروتوكول المرافق مكتوب. انتظر ساعتين بعد الحقن خريطة موقع قبل التخدير الماوس والمضي قدما في العدوى داخل الأنف.
إعداد الكيتامين باستخدام التخدير وزيلازين عند 100 ملغ / كلغ و 10 ملغ / كلغ على التوالي (7). - خلال فترة الانتظار 2H ، وإعداد اللقاح capsulum النوسجة كما هو موضح في البروتوكول المرافق مكتوب.
- يسير وفقا لitens 5،1-5،5. إصبع قرصة الحيوانات مع منتاش والتحقق من عدم وجود منعكس وتؤكد أن عمل التخدير ، وبعد تخدير أو تعليق بلطف الماوس بواسطة أسنانها الأمامية إلى سلسلة من النايلون أو القطن. استخدام يقف العمود 2 لربط خيوط من أجل وقف هذه الحيوانات.
- إدارة ببطء نحو 50 ميكرولتر قيحة إلى n هل باستخدام micropipette بينما تراقب عن كثب معدل الماوس ، التنفس. السماح للماوس للراحة في هذا المنصب لمدة 2-5 دقيقة بعد الإصابة الأنف لتسهيل ترسب الخميرة في الرئتين الحيوان (الشكل 3F).
- بعد إصابة الفأر ، والحفاظ على الماوس في البيئة ، ورصد دافئة (درجة الحرارة بين 25 و 37 درجة مئوية) ، وذلك باستخدام بعناية مصباح الحرارة إذا لزم الأمر ، حتى يتعافى من التخدير. عندما يستيقظ الفأر ، إعادته إلى قفص نظيفة بالمال وبالشهرة أيضا مع وصول الفريق الى الغذاء والماء. هي عادت إلى أقفاص الحيوانات لدينا منشأة ويحتفظ بها في غرفة نظيفة الحيوانية (BLSI).
6. بقاء الدراسات
- تقييم الحيوانات المصابة بالعدوى وهمية ، سريريا لتسرع النفس والخمول ، وobtundation ، وفقدان الوزن. يجب فحص الحيوانات مرتين يوميا على أيدي أفراد المختبر واليومية من قبل أولياء الحيوان.
- المنسجات مع الفئران ، وحتى على مقربة من نهاية الحياة ، وعادة ما تكون هناك أية علامات للعدوى أخرى من حدوث زيادة معتدلة في معدل التنفس. مع متقدمة من المرض ، والذي يحدث عادة 10-11 يوما ، والفئران بشكل كبير وأصبح tachypneic قد يتناقص النشاط. عادة ما يصبحون بسرعة وتنتهي المحتضرة.
- وينبغي أن يتم التخلص الحيوانات بالأسى على نحو مناسب مع CO 2 في غرفة مخصصة ، ينبغي أن تعداد الحيوانات المتوفون اليومية.
7. CFU الدراسات ، وعلم الأنسجة السيتوكينات الدراسات
- إعداد أنابيب مخروطية 15 مل مع برنامج تلفزيوني 10ML عن كل جهاز يتم تحصيلها.
- الموت ببطء الحيوانات 7 و 14 أيام بعد الإصابة مع inuculum شبه مميتة (5.0 × 10 6) كما هو موضح سابقا وإزالة الرئة والطحال والكبد على الفور.
- إزالة قطعة من الجهاز ليتم تقييمها وإجراء التثبيت في الفورمالين بين عشية وضحاها. وسيتم فحص الأجزاء تحت المجهر لتقييم المرضية.
- وتصدرت أنابيب مخروطية تجهيز 50 مل مع برنامج تلفزيوني 5mL مع 70 خلية مصافى ميكرومتر لكل جهاز لتكون متجانسة. أضعف كل جزء المتبقي من الأجهزة بشكل منفصل في أنابيب سعة 50 مل باستخدام المحاقن المعقمة الغطاسون 5mL.
- المقبل ، مخفف تسلسليا الخليط الجهاز (1:100 ، 1:1000 و1:5000) ، وطبق كل 100μL التخفيف على لوحات أجار بهي الدم (2).
- إضافة أقراص مثبط البروتياز إلى الخليط وفقا لتعليمات لصنع (روش ، ألمانيا).
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما ، وCFUs تعداد.
- أجهزة الطرد المركزي في الجهاز الخليط في 4000xg لمدة 10 دقيقة وإزالة supernatants الجهاز ، سوف تستخدم في حفيف المستخدمة في المقايسات خلوى التي يؤديها وفقا للطرق القياسية الشركة المصنعة.
8. وحيدة النسيلة حماية جسم ضد H. المغمدة يعتمد على خصوصية جسم وIsotype
- MAB isotype أمر حاسم في حماية ضد H. المغمدة ، والفئران التي عولجت مع IgG1 أو MABS IgG2a إلى البقاء لفترات طويلة قد Hsp60 ملحوظ بالمقارنة مع الفئران التي تحكم تلقي خريطة موقع لIgG2b Hsp60 أو بإحدى هاتين العقوبتين عنصر تحكم isotype خريطة موقع أو برنامج تلفزيوني (الشكل 4).
- كذلك ، في الفئران التي تلقت MABS الواقية ، كان هناك انخفاض كبير في عدد CFU الرئوي والتهاب الطحال في يوم 7 ويقلل من وحدات (2) وسجل 2.5 من أعداد الخميرة في الرئتين في يوم 14 (الشكل 5).
الشكل 1 : نمو H. المغمدة وhybridomas. (A) HAM السائل إعداد F - 12 من ثقافة مستعمرة واحدة حصل عليها من H. المغمدة نمت على لوحات أجار بهي الدم. (ب) ورم هجين النمو في قوارير خلية ثقافة وخريطة موقع تنقية البروتين التي كتبها A / G cromatography راتنج تقارب به.
الشكل 2 : H. المغمدة إعداد اللقاح للعدوى الأنف. تعليق خلية تم الحصول عليها بعد H. يتم تعداد المغمدة المجاميع التي تعطل المحاقن والطرد المركزي من خلال إحصاء في عدادة الكريات. يتم ضبط تركيز الخلية إلى 1.25 × 10 7 (تجارب البقاء) أو 5 × 10 6 (CFUs ، السيتوكينات والأنسجة) في ميكرولتر 50 <.
upload/2532/2532fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "/>
الشكل 3 : التعامل مع الفأر خلال خريطة موقع الإدارة. (أ) يتم انتقاؤها من قبل الفأر الذيل و(B و C) وظائفها من خلال عقد القفا من عنقه ، وعلى مقربة من theears. (د) عقد الذيل بين الاصبع الصغير والنخيل. (E) والحل هو حقن خريطة موقع باستخدام إبرة 26G1 / 2. (F) وحاء ويدار بواسطة الأنف المغمدة قيحة pipetting بلطف تعليق الخلية الى n هل.
الشكل 4 : MABS Hsp60 يمكن أن يغير إلى التسبب في المنسجات. IP الحقن مع 500 ميكروغرام من IgG1 ، أو IgG2a MABS 2 ح قبل لبقاء لفترة طويلة بشكل ملحوظ العدوى (ع <0.05 ، مقارنة مع الضوابط) ، ولكن خريطة موقع IgG2b.
الشكل 5 : قرارات CFU في الرئتين في 7 و 14 يوما بعد الطعن في الأنف دون المميت مع الخمائر HC 5x10 6 من الفئران تعامل مع IP MABS Hsp60 المحدد إلى غير ذي صلة أو خريطة موقع أظهرت انخفاض العبء عن IgG1 الفطرية وIgG2a MABS معاملة الحيوانات. أشرطة سوداء تمثل CFUs في يوم 7 و 14 يوما أشرطة بيضاء بعد العدوى (* P <0.001 في 7 أيام و** ع <0.001 في 14 إصابة آخر أيام).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يدل على أن خريطة موقع لحاء يمكن المغمدة تعديل مسار المنسجات الفئران المختبرية. يمكن MABS لمستضدات سطح الخلية من مسببات تعديل الديناميكيات المعقدة التي تحدث خلال التفاعل بين المضيف والممرض ملف. هذه الدراسة على أن حماية MABS التوسط في نموذج الفئران من المنسجات المميتة عند حقنه intraperitoneally ، وهذا يدل على البروتينات مرشح لتطوير اللقاح ، مثل H2B ، M مستضد (سطح الكاتلاز) (3) وHsp60. في الجسم الحي ، خفضت إدارة MABS وقائية لHsp60 HC وH2B عبء الجهاز الفطرية والالتهابات والبقاء لفترات طويلة من الفئران المصابة.
على الرغم من تطوير لقاح لحاء المغمدة هي منطقة مثيرة للبحوث ، قد لا تكون فعالة تطعيم الأفراد في المناعة ، لأنها لا يمكن أن تنسق بالضرورة immunoresponse. وبالتالي ، فمن الواضح أن هذه الفئة من السكان معظمهم قد تستفيد من العلاج السلبي مع خريطة موقع لحاء المغمدة مستضدات. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن MABS ، وخاصة لHsp60 أو بالاشتراك مع غيره MABS لمستضدات سطح الخلية ، ويمكن تحسين معاملة المرضى الذين يعانون من داء النوسجات (4 ، 6). بالإضافة إلى ذلك ، مزيج من خريطة موقع لحاء يمكن المغمدة مع العلاج بالعقاقير المضادة للفطور يكون التآزر وأكثر فعالية في فعالية الحماية. الأمفوتريسين B هو الدواء المفضل ، وعادة ما يستخدم للعلاج الأولي لالمنسجات. وبالتالي ، ينبغي النظر في إضافة خريطة موقع إلى العلاج بالعقاقير المضادة للفطريات في الدراسات المستقبلية. في الواقع ، لقد أثبتنا سابقا تأثير المتآزر لMABS لH2B وشبه المثبطة تركيزات الأمفوتريسين B في نموذج حيواني لدينا (5). وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تدار MABS اتقائيا في تفشي داء النوسجات ، وخصوصا المعرضة لمخاطر الأفراد ، مثل الأفراد مع فيروس نقص المناعة البشرية العدوى أو المرضى الذين يتلقون مثبطات TNF - α. قد التحقيقات مستقبل خريطة موقع الحماية تكشف معلومات هامة إضافية في التسبب في المنسجات وظيفة الأجسام المضادة ضد ه. المغمدة ، وربما غيرها من مسببات المرض داخل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
