使用吊重系统在小鼠肝缺血

Summary

我们建立了一个门户黑社会闭塞的吊重系统的一种新的小鼠模型。这项技术可能有助于为今后的调查，在小鼠肝模型缺血。

Abstract

因缺血的急性肝损伤过程中可能出现一些如肝移植，肝肿瘤切除或创伤修复的临床程序，并可能导致肝功能衰竭，具有较高的死亡率^1-2。因此小鼠肝缺血的研究已成为一个重要的研究领域提供了机会，利用药理学和遗传学研究^3-9。具体来说，有条件组织特定基因缺失小鼠（CRE，FLOX系统）提供了的蛋白质在特定组织的作用^10-13见解。由于手动夹紧小鼠入肝，与相 ​​关的技术难度，我们进行了系统评价，使用悬重系统已先前所描述的³入肝闭塞。使用吊重系统，我们将不会造成任何损害肝瓣缝合周围的左支入肝，因为还最好的夹子可用可引起肝组织的损伤，由于肝组织的船只密切位置。此外，右支，肝黑社会仍然从而灌注血流量，肝右叶保留，没有肠道淤血发生这种技术。此外，入肝只操纵在整个手术过程一次。因此，程序，如空调前，缺血再灌注短的时间，可以很容易地进行。这个模型通过执行不同的缺血再灌注时间的系统评价发现与肝损伤的肝缺血时间密切相关，由丙氨酸（ALT）和天门冬氨酸（AST），血清转氨酶水平^3,9。两者合计，这些研究证实，高重现肝损伤，肝缺血和间歇性灌注悬重系统时使用。因此，这种技术可能是有用的其他研究者的兴趣在小鼠肝脏缺血研究。因此，视频剪辑，这种技术提供了一个详细的一步一步的描述。

Protocol

大会发言。所有操作应执行下一个堂堂正正的解剖显微镜（Leica），并通过使用手术凝固剂。在实验和假手术组的小鼠应在年龄和体重相匹配，以确保结果的可比性。应该是稳定的体温，血压，麻醉和流体管理和监控整个实验过程中。 1。麻醉和手术 C57BL / 6小鼠应该是10至16周的年龄范围内，他们应该在各自的群体性别相匹配的。 麻醉小鼠戊巴比妥钠（70毫克/公斤体重IP），约维持麻醉。 10毫克/千克/小时戊巴比妥钠。过量可显着降低血压，从而可以改变的结果。 广场上的温度控制加热表（RT，埃芬博格，德国慕尼黑）小鼠直肠温度计探头连接到热反馈控制器，以保持体温在37°C。 地方小鼠在手术台上仰卧位，上肢和下肢表附有可拆卸的磁带。 在生存实验的情况下，适当的无菌技术，包括裁剪头发，皮肤消毒，用碘伏（如优碘），蒸压仪器的无菌处理，并使用无菌手套口罩医生是必需的。 2。门户三合会闭塞用矿物油覆盖切口区，以防止吸入鼠标头发，皮肤切割，从而防止鼠标毛过敏的风险。执行白线和中线剖腹切口上端，使您可以轻松地暴露肝脏。如果可能的话，执行，以防止出血与凝血电极（ERBE，ICC50，图宾根，德国）的切口。 将加热表，用鼠标在一个位置，尾巴是方向泰德医生。这一立场提供本地化的黑社会，并放置缝合的最佳设置。 取代用湿棉棒棉签揭露入肝右侧肠。 稍微转向对膜片的中位数和左叶和右叶对肠道。这会给你一个明确的说法入肝右，左，中位数/叶分叉以上。 仔细检查入肝举行平淡钳右叶，轻轻放下。这会给你一个很好的左侧入肝。 一旦视觉识别（7/0尼龙线;爱惜康，Norderstedt的，德国）与缝合针持针器通过左入肝下的，包括肝动脉，肝静脉和胆管从左侧到右侧鼠标。 十字绣是黑社会下密切合作。针可以伤害更深位于下腔巴卡劣质黑社会。因此保持与右侧肝叶钳查明前腔静脉放置针。 以镊子取针右侧的一角，轻轻地不伤肝，肝区拉出。 附加到每个缝合Eppendorf管（约3克，装满水），将两者缝合超过缝合持有结束。缝合持有人将远端的针，使缝合不正确的黑社会干扰。 黑社会所采用的权重将立即闭塞，引起肝脏的左，中位数叶的血液供应中断。成功闭塞，可以很容易地证实缺血叶苍白热烫的视觉检查。相比之下，颜色变化立即消失，吊重时从两极释放和再灌注肝脏。这部分肝缺血模型，避免了维护布卢肠系膜充血正确的肝叶的三维流。 取代肠道进入腹腔。保持肝脏和小肠温暖的湿棉签用清水浸泡在37.0°C。此外，以保持体温稳定的市售食品保鲜膜覆盖完成手术后的小鼠。 执行缺血为实验方案的要求。定义的缺血时间释放后的重量和再灌注损伤的中位数和左肝叶将立即开始。这项技术使生产可逆性缺血小鼠。如果没有进一步的缺血时间将小心地取出缝合。 进入前15分钟和再灌注后直接腹腔加入约400μL氯化钠。继续在100μL，以弥补在再灌注时间的流体损失的金额来代替液每隔30分钟。 生存实验外科伤口闭合用连续缝合肌肉壁和皮肤的Wi第4/0缝线。 3。肝脏灌注的变化建议确定以下肝损伤肝缺血以下结果参数： 确定肝酶（如血清ALT，AST）和肝组织病理（H＆E染色）以下的肝脏缺血再灌注3,9。 图1对肝脏缺血悬重系统型号：吊重系统已经建立，诱发肝缺血的左，中叶3。 （一）因此，尾和肝右叶，左叶轻轻分开。右叶再稍微转移到清楚地查看上面的右，左，中位数和叶分叉入肝。 8.0尼龙线被划归左肝黑社会。 （二）3克离心涂在小，重量轻（每个缝合结束装满水的BES）重视和应用。肝脏缺血再由左中叶从红色到浅的颜色的变化是可见的。这个实验设计，可以精确的闭塞和再灌注左肝黑社会的申请和释放负重。 图2。不同的肝缺血时间对丙氨酸（ALT）和天门冬氨酸（AST）在小鼠转氨酶。局部的入肝缺血诱导指示（0 – 60分钟缺血）。再灌注2小时后，谷丙转氨酶（A）和助攻（二）进行了测量。结果表示为平均值±SE 6 – 7小鼠/组。 *与0 min缺血（假手术对照组）相比，P <0.05。

Discussion

本研究中描述的执行缺血小鼠模型中，由闭塞的左肝入肝使用吊重系统的技术。虽然这是一个简单的方法来学习，应考虑以下的陷阱。在开始时很常见的错误是一种深深的缝，其中包括入肝和腔静脉。在15分钟内，由于阻力增加和减少血液返回​​到心脏造成小鼠的早期死亡的呼吸和心脏的速度将放慢。最好的办法，以防止包括腔静脉定位针前腔静脉右叶用钳子。另一个重要问题是，权重不重，这可能会导致太多压力也停止血流到右叶的左边和右边的门户试验。因此，在离心瓶的水的量应调整​​鼠标的重量和Suture持有人应放在远端缝合位置。相反，如果权重低的血压没有完全停止。这两种错误是不易察觉的一个额外的中位数和左叶，右叶或颜色变化不足苍白的颜色变化，分别。因此，肝的颜色变化，运用权重后，应控制在每次10分钟。另一种常见的手术并发症是肝针受伤。因此，应按住右叶一个平淡的镊子，针尖，这样可以很容易看到，并与持针器。如果这些缺陷在开始考虑为肝缺血悬重系统提供了一个高度可重复性，减少变异肝损伤夹紧入肝缺血损伤。使用吊重系统，入肝仅操作一次，在整个手术过程中，造成肝瓣显着减少伤害。此外，无肝，肠充血，发生这种技术。发生更多的组织创伤血管钳，拆卸和更换，尤其是在多个缺血周期，如在缺血预处理钳补办。使用挂在肝组织的远程位置的权重，根据我们的观察，提供了可靠的闭塞的优势，同时防止因操纵钳补办肝叶组织创伤。两者合计，目前的研究提供了入肝闭塞缺血悬重系统的可行性，尽量减少与夹紧的变异和相关的限制。因此，这种技术可能会感兴趣的其他研究者考虑研究肝缺血。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4 mg/mL in saline
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		Forceps, needle holder
Coagulator	Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany	n/a	Different providers of coagulators

Table 1. Specific reagents and equipment.