Bedöma Signalering egenskaper Ectodermal epitel Under Kraniofaciala utveckling

Summary

Den här artikeln beskriver en teknik vävnadstransplantation som var utformat för att testa signalsystemet och egenskaper mönstring av ytor cefaliska ektoderm under kraniofaciala utveckling.

Abstract

Tillgängligheten av aviär embryon har hjälpt experimentell embryologer förstå öden celler under utveckling och roll vävnad interaktioner som reglerar mönstring och morfogenes av ryggradsdjur (t.ex. ^{1, 2, 3, 4).} Här visar vi en metod som utnyttjar denna tillgänglighet för att testa signalering och egenskaper mönstring av ektodermal vävnader vid ansikts utveckling. I dessa försök skapar vi vaktel-chick ⁵ eller mus-chick ⁶ chimärer genom att transplantera ytan cefaliska ektoderm som täcker den övre käken från vaktel eller musen på antingen samma region eller en ektopisk region kycklingembryon. Användningen av vaktlar som givare vävnad för transplantation till kycklingar har utvecklats för att dra fördel av en nucleolar markör som finns i vaktlar men inte kycklingembryoceller, vilket gör utredare att skilja värd och vävnader donator ^7. Likaså är ett återkommande inslag som finns i musens arvsmassa och uttrycks ubiquitously, som tillåter oss att skilja värd och vävnader givare mus-chick chimärer ^8. Att använda musen ektoderm som givare vävnad kommer kraftigt att utöka vår förståelse för dessa vävnad interaktioner, eftersom detta ger oss möjlighet att testa signalering egenskaper ektoderm härleds från olika mutant embryon.

Protocol

1. Förbereda givare Tissue

1. Förbered kulturmedia slipa glas stift, vässa volfram nålar.
2. Samla embryo från Shell, tvätta i iskallt PBS.
   1. Använd en 10 ml spruta och en 18 gauge nål bort 1,0 ml av albumin från den spetsiga änden av äggskal.
   2. Gör ett litet hål på toppen av skalet med den punkt sax och klipp sedan en rund öppning att exponera embryot
3. Ta bort huvud och placera i DMEM (serum gratis, rumstemperatur)
4. Dissekera Frontonasal processen från embryo (eller andra givare webbplats som överkäken eller underkäken process)
5. Digest i 2.4U / ml dispase i PBS på is för 20mins
6. Täck vävnader med DMEM med 1% BSA för att stoppa matsmältning
7. Använd vässade volfram nål för att separera ektoderm, mesenkym och neuroectoderm
8. Förvara graft vävnad i DMEM 1% BSA på is tills värd är redo för transplantation

2. Förbereda värd

1. Avslöja embryot
   1. Använd en 10 ml spruta och en 18 gauge nål bort 1,0 ml av albumin från den spetsiga änden av äggskal.
   2. Gör ett litet hål på toppen av skalet med den punkt sax. Lägg en bit tejp över hålet och sedan skära en rund öppning att exponera embryot.
2. Använda 2 par pincett, ta tag i amnion och försiktigt riva för att göra ett hål.
3. Vrid huvudet genom att placera en pincett på höger öga och påtryckningar. Håll huvudet stadigt, använd en tungsten nål för att ta bort värden ektoderm att tillgodose transplantat.
4. Överför graft till värden med hjälp av ett glas pipett.
5. Placera transplantat för att ersätta den borttagna ektoderm. Sätt ett glas stift i varje hörn av de ympade vävnaden till stift transplantat på plats. För att göra glas stift, dra en microcapillary rör till en fin spets över en alkohol låga.
6. Placera tejp tätt över hålet och återgå embryo till inkubatorn för lämplig tid för analys.
7. Se också: ⁹

3. Representativa resultat:

För att bedöma chimärer bör embryon samlas in och bearbetas för analys av fördelningen av värden och vävnader donator. För detektion av vaktlar celler, immunohistokemi med QcPN antikropp (beskrivs i: ³⁾ är anställd, och för upptäckt av musceller, in situ hybridisering på paraffin används ^6. Donator celler bör vara begränsad till epitelet, och det borde finnas några bevis för givare mesenkymala vävnader (figur 1). Förekomsten av isolerade donator celler i mesenkym indikerar förekomst av kontaminering neurallist celler som kommer att förbrylla alla morfologiska tolkning på grund av påverkan av dessa celler på många aspekter av ansikts utveckling (t.ex. ^10). När övertygad om att transplantatet tekniken är fri från kontaminerande mesenkym kan ytterligare morfologiska eller molekylära effektmått användas för att bedöma chimärer. För våra syften, upptäckte vi att det finns för ektopisk brosk och ben som motsvarade dubblering av överkäken som framkallas av de transplanterade vävnader (figur 2), och molekylära förändringar i mesenkymala vävnader som svar på ympade ektoderm (Figur 3) ^5,6.

Figur 1. Bedömning av chimerism (A) Anti-QcPN färgning används för att upptäcka vaktel celler i vaktlar-chick chimärer. Det finns inga belägg för färgning i mesenkym. (B) In situ hybridisering används för att upptäcka uttryck för avskrifter SINE B2 i mus-chick chimärer. Expression är begränsad till ektoderm bestående av transplantat.

Figur 2. Trikrom färgning visar dubblering av överkäken skelettet i (A) vaktel-chick chimär, och (B) mus-chick chimärer.

Figur 3. Ektoderm regultes genuttryck i mesenkym. (A) Normal Bmp7 uttryck i mesenkym en kycklingembryo (radioaktiva in situ hybridisering med positiv signal pseudo-röd i Adobe Photoshop). (B) Bmp7 uttryck är induceras i mesenkym intill transplantat (pil) i chimär embryon.

Discussion

Med denna transplantation metoden har vi kunnat fastställa att ektoderm innehåller signalering information som reglerar dorsoventral polaritet och proximodistal förlängning av överkäken. Likheten mellan resultat vid användning av vaktel eller musen ektoderm, och bevarandet av molekylära signaler i denna vävnad bland många arter ^6,11 indikerar att detta är ett starkt konservativa signalering centrum bland ryggradsdjuren. Dessutom har andra forskare använt liknande tekniker för att testa signalering egenskaper hos olika regioner av yta cefaliska ektoderm och har upptäckt att det finns flera signalering center beläget i ektoderm som bidrar till morfogenes i ansiktet ^12. Denna metod ger oss möjlighet att öka våra kunskaper om den roll som olika vävnader, samt regionala skillnader i vävnaderna, spelar under ansikts utveckling. Slutligen, genom att kombinera styrkan hos möss med styrkan av aviär-chimär system vi kommer att kunna belysa molekylära mediatorer av epitelceller-mesenkymala samspel under utveckling, och vi kommer att kunna identifiera de mekanismer genom vilka dessa interaktioner reglerar utveckling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.	TEKZR114
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petri dish	Falcon BD	1008
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Spring Scissors	Fine Science Tools	15010-11
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000
Microcapillary tube	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-6B
Spring scissors	Fine Science Tools	15010-11
Blade holder	Fine Science Tools	10052-11
Razor blade	Fine Science Tools	10050-00