Summary
Una demostración de la fabricación y el uso de un electrodo de succión extracelular para medir los registros electrofisiológicos de los cables de la columna vertebral de roedores recién nacidos
Abstract
Desarrollo de circuitos neuronales y la locomoción pueden ser estudiados usando roedores recién nacidos la médula espinal centro generador de patrones (CPG) de comportamiento. Demostramos un método para la fabricación de electrodos de succión que se utilizan para examinar la actividad de GPC, o la locomoción ficticia, en los cables de roedores disecados espinal. Los cables de la columna vertebral de roedores se colocan en líquido cefalorraquídeo artificial y las raíces ventrales son atraídos hacia el electrodo de succión. El electrodo se construye mediante la modificación de un electrodo de succión disponible en el mercado. Un hilo de plata pesada se utiliza en lugar del cable estándar proporcionada por el electrodo en el comercio. La punta de vidrio del electrodo comercial se sustituye con una punta de plástico para mayor durabilidad. Preparamos la mano electrodos dibujados y electrodos hechos de tamaños específicos de tubos, lo que permite la consistencia y la reproducibilidad. Los datos se recopilaron mediante un amplificador y un software de adquisición de neurogram. Las grabaciones se realizaron en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday para evitar la interferencia mecánica y eléctrica, respectivamente.
Protocol
Registros electrofisiológicos de la médula espinal aislada puede revelar cambios genéticos y del desarrollo de circuitos neuronales 1. Hemos demostrado previamente un método para analizar los cables neonatal espinal de ratón 2. Aquí presentamos un método para preparar electrodos de succión útil en la grabación de la locomoción ficticia en la médula espinal aislada 3.
La punta de un electrodo de un tubo de plástico se pueden extraer de una punta muy fina a mano usando una lámpara de alcohol de baja temperatura 3.5. El tubo de plástico (PE90, Clay Adams Intramedic TM) se lleva a cabo sobre la llama para ablandar la tubería en una forma maleable. Como el tubo comienza a derretirse y se vuelve más transparente que se extrae de la fuente de calor y los extremos se tira suavemente de distancia. El momento de retirar el tubo de la llama es importante para asegurar que el plástico no se derrumbe o se separan, mientras está dibujando. La parte fina de la tubería se corta con una cuchilla de afeitar de acuerdo con el diámetro deseado interna, según lo dictado por la edad de la muestra o el nivel segmentario de la médula. Para facilitar la colocación de una junta tórica en el tubo, un corte de 45 ° se realiza en el extremo grueso de la tubería con una cuchilla de afeitar. Un casquillo y la junta tórica se instalan en el extremo más grueso para conectar el extremo del electrodo en el cañón del electrodo.
Para permitir que los electrodos de un tamaño específico y evitar las dificultades de la mano tirando puntas de los electrodos, los electrodos pueden ser construidos usando tubos de pequeño se inserta en un tubo grueso (PE90). Las longitudes de las tuberías son específicas para los requisitos de la configuración de la grabación y son variables. Se presentan las medidas utilizadas en nuestros experimentos 1-3,5. Una longitud de 1 cm de tubo de PTFE fina (Zeus, piezas pequeñas) y una longitud de 10 cm de tubería PE90 se cortan con una cuchilla de afeitar. Los extremos de los tubos pequeños deben ser examinados para asegurarse de que no se trituran o se cierra. Que se pueden abrir con un pin de insectos (Herramientas Artes Ciencia). Una gota de adhesivo (JB Weld) se coloca en el punto medio del tubo de PTFE. Los tubos de PTFE y adhesivo se dibujan en el tubo de succión con la boca PE90 en la tubería PE90. Un corte de 45 ° se realiza en el extremo grueso de la tubería y un casquillo y la junta tórica se adjuntan, que el anterior.
El conector BNC férula y se desenrosca de un electrodo de succión comercial. El conector BNC se sumerge en xileno durante una hora para quitar el sello de cera. El conector se enjuaga en agua y se seca.
Un puerto del lado inferior en ángulo deben hacerse en el lado del cañón. Una barra de metal se calienta con un mechero de Bunsen y se introduce en el agujero existente en el lado del cañón en un ángulo bajo. Una longitud de 15 cm de alambre de plata .010 pulgadas (AM Systems) se corta y empapado en lejía durante quince minutos. Esto se hace para crear una capa de cloruro de plata que ayuda a la conducción de la señal 6. El cable se enjuaga con agua, se seca, y luego soldar en el conector BNC. El cable conector BNC y la plata se introduce en el cañón de electrodos de aspiración con suficiente espacio para el conector BNC para permanecer al lado del cañón. Tubo de succión se inserta en el orificio lateral de 2-3cm. Sellador de silicona que se inyecta en el cilindro de aproximadamente 2 a 3 cm. El conector BNC se enrosca en el barril del electrodo empujando el sellador hacia adelante.
La punta del electrodo está enroscado en la parte delantera del electrodo. Tubo de contracción también se pueden añadir para reforzar la línea de aspiración desde el puerto de lado.
Los electrodos se montan en micromanipuladores que sujetarse a la base magnética, y se coloca cerca de la fuente de grabación. BNC cables coaxiales están conectados a un cabezal que está conectado a un amplificador. El amplificador está conectado a un adaptador (PolyView) que está conectado a una tarjeta de analógico a digital (National Instruments) en un ordenador PC con el software de adquisición de datos (PolyView).
Al grabar datos electrofisiológicos, es necesario eliminar todas las interferencias externas. El plato de grabación, un amplificador y etapa de la cabeza se colocan en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday para evitar las interferencias eléctricas y mecánicas, respectivamente.
Los resultados representativos:
Figura 1. Un electrodo de succión disponible en el mercado pueden ser modificados mediante la adición de un alambre de calibre pesado plata y una punta de plástico que es dibujado a mano en una lámpara de alcohol, o construido con tubos de plástico disponibles en el mercado de tamaños específicos. Además, el sellador de parafina se sustituye con más sellador de masilla de silicona durable.
Figura 2. Un esquema de los electrodos de aspiración en relación con la mesa de aire (para aislamiento mecánico), jaula de Faraday (eléctrica isolatide), un amplificador y una computadora. Cabe señalar que hay una referencia a tierra al plato de grabación y un segundo motivo que se hace referencia a la mesa de aire y la jaula de Faraday.
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Discussion
Desarrollo del sistema nervioso pueden ser estudiados usando los cables aislados de roedores espinal. En presencia de los neurotransmisores, la locomoción ficticia puede ser generada a partir de la médula espinal en forma de patrones de actividad eléctrica 1,3. Estas explosiones rítmicas se producen en el 0,2 a 0,5 Hz y siguen el modelo de alternancia izquierda-derecha y flexor extensor. En diferentes etapas de desarrollo, la solidez y los patrones de esta actividad varía de 1. Las mutaciones genéticas también pueden alterar el patrón de esta actividad 3,5,7. Estudios transgénicos y el desarrollo de esta actividad proporciona una visión de la organización de los circuitos centrales de patrones de generación e informar a los estudios del desarrollo neuronal, por lo general.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff es profesor en el Laboratorio de Expresión Génica en el Instituto Salk de Estudios Biológicos y un investigador en el Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por el Christopher y Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Schnoeker Kent y Mike Sullivan en Recursos Multimedia en el Instituto Salk proporcionó asistencia con la fotografía y la edición.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
