Summary
הפגנה של ייצור ושימוש אלקטרודה יניקה תאיים המשמשת למדידת אלקטרו הקלטות של מיתרי מכרסם השדרה בילוד
Abstract
פיתוח circuitries עצבי תנועה ניתן ללמוד באמצעות מכרסם בילוד חוט השדרה המרכזי דפוס גנרטור (CPG) התנהגות. אנו להדגים שיטה לייצר אלקטרודות שאיבה המשמשים לבחינת פעילות CPG, או תנועה פיקטיבי, על מיתרי מכרסם גזור השדרה. מיתרי מכרסם השדרה ממוקמים הנוזל השדרתי מלאכותי לשורשי הגחון נמשכים אל האלקטרודה יניקה. אלקטרודה בנויה על ידי שינוי אלקטרודה יניקה זמינים מסחרית. חוט כסף כבד משמש במקום חוט תקן שניתן על ידי האלקטרודה זמינים מסחרית. קצה הזכוכית על האלקטרודה מסחרי מוחלף עם קצה פלסטיק עמידות מוגברת. אנחנו מכינים אלקטרודות נמשך יד אלקטרודות עשויות בגדלים מסוימים של צינורות, המאפשר שחזור עקביות. הנתונים נאספו באמצעות מגבר ורכישת תוכנה neurogram. הקלטות מבוצעות על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי כדי למנוע הפרעות מכניות וחשמליות, בהתאמה.
Protocol
הקלטות אלקטרו של מיתרי השדרה מבודד יכול לגלות שינויים גנטיים והתפתחותיים על המעגלים העצביים 1. אנחנו קודם לכן הפגינו שיטה לנתח מיתרי עכבר בילוד השדרה 2. כאן אנו מציגים שיטה להכנת אלקטרודות יניקה שימושי הקלטה תנועה פיקטיבי של מיתרי השדרה מבודד 3.
קצה אלקטרודה צינורות פלסטיק ניתן להסיק עד קצה דק מאוד ביד באמצעות מנורה בטמפרטורה נמוכה אלכוהול 3-5. צינורות הפלסטיק (PE90, קליי אדמס Intramedic TM) מוחזק על הלהבה כדי לרכך את צינורות לצורה נזיל. כמו צינורות מתחיל להתמוסס והופך שקוף יותר הוא מוסר ממקור החום מסתיים הם משכו בעדינות לגזרים. העיתוי של הוצאת צינור מהאש חשוב להבטיח הפלסטיק לא יקרוס או לפצל בעוד נמשכים. החלק הדק של הצינור הוא חתך בסכין גילוח לפי קוטר פנימי הרצוי, כמו מוכתב על ידי גיל הדגימה או רמת סגמנטלי של חוט. על מנת להקל על ביצוע O-טבעת על צינורות, חתך 45 ° נעשית בסוף עבה של צינורות עם סכין גילוח. טבעת חזוק A ו-O-טבעת מותקנים על קצה עבה לצרף את קצה האלקטרודה על חבית של האלקטרודה.
כדי לאפשר אלקטרודות בגודל ספציפי למנוע את הקשיים של יד משיכת טיפים אלקטרודה, אלקטרודות ניתן לבנות באמצעות צינור קטן מוחדר צינור עבה (PE90). אורכי בצינור הן ספציפיות לדרישות של הגדרת הקלטה משתנה. אנו מציגים את המדידות השתמשו בניסויים שלנו 1-3,5. אורך 1cm של צינורות PTFE קנס (זאוס, חלקים קטנים) ו - 10 ס"מ אורך של צינורות PE90 נחתכים בסכין גילוח. קצוות של צינורות קטנים צריכים להיבדק כדי לוודא שהם אינם כתוש או סגור. הם יכולים להיפתח באמצעות סיכה חרקים (כלים המדע פיין). ירידה של דבק (JB וולד) ממוקמת על נקודת האמצע של צינורות PTFE. צינורות PTFE דבק נמשכים לתוך צינורות PE90 באמצעות יניקה הפה על צינורות PE90. לחתוך 45 ° נעשית בסוף עבה של צינורות ועל טבעת חזוק ו O-טבעת מחוברים, כמו הקודם.
מחבר BNC ו טבעת חזוק הם פירק מן אלקטרודה יניקה מסחרי. מחבר BNC היא ספוגה קסילן במשך שעה אחת כדי להסיר את חותם השעווה. מחבר היא שטפה אז במים יבשים.
נמל התחתון בצד זווית חייבת להתבצע בצד של החבית. מוט מתכת מחומם באמצעות מבער בונזן ולחץ לתוך החור הקיים בצד של הקנה בזווית נמוכה. אורך 15 ס"מ של חוט כסף 0.010 אינץ' (AM Systems) היא לגזור טבול באקונומיקה במשך רבע שעה. זה נעשה כדי ליצור ציפוי כסף כלוריד המסייע הולכה אות 6. חוט היא שטפה עם מים, יבשים, מולחמים אז על המחבר BNC. חוט מחבר BNC וכסף מוכנסים לתוך חבית יניקה אלקטרודה עם מספיק מקום מחבר BNC להישאר בצד של החבית. צינורות יניקה מוכנס לתוך הנמל בצד 2-3 ס"מ. סיליקון איטום מוזרק לתוך החבית כ 2-3 ס"מ. מחבר BNC הוא מושחל לתוך חבית של האלקטרודה דוחפים את איטום קדימה.
קצה האלקטרודה הוא מושחל לתוך עכשיו הקצה הקדמי של האלקטרודה. צינורות הפסיכולוג ניתן גם להוסיף ולחזק את קו יניקה מנמל לוואי.
אלקטרודות הם רכובים על micromanipulators המצורפים עומד מגנטי, והניח ליד צלחת את ההקלטה. כבלים קואקסיאליים BNC מחוברים headstage שהוא מחובר למגבר. המגבר מחובר למתאם (Polyview) שמחובר אנלוגי לדיגיטלי כרטיס (מכשירים הלאומי) על מחשב PC עם תוכנת רכישת נתונים (Polyview).
בעת הקלטת נתונים אלקטרו, יש צורך לסלק את כל התערבות חיצונית. המנה הקלטה, מגבר, בשלב הראש מונחות על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי כדי למנוע הפרעה חשמלית מכנית, בהתאמה.
נציג תוצאות:
באיור 1. אלקטרודה יניקה זמינים מסחרית ניתן לשנות על ידי הוספת כסף כבד מד תיל טיפ פלסטיק כי הוא נמשך על יד מנורת אלכוהול, או לבנות עם צינורות פלסטיק זמינים מסחרית בגדלים ספציפיים. בנוסף, איטום פרפין מוחלף יותר סיליקון איטום עמיד קולק.
איור 2. סכימטי של האלקטרודה יניקה ביחס שולחן אוויר (עבור בידוד מכני), כלוב פאראדיי (חשמל isolatiב), מגבר ומחשב. יצוין כי קיימת קרקע הפניה אל צלחת הקלטה קרקע השני הוא הפניה אל שולחן אוויר כלוב פאראדיי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפתחות מערכת העצבים ניתן ללמוד באמצעות מיתרי מכרסם מבודד השדרה. בנוכחות של נוירוטרנסמיטורים, תנועה פיקטיבי יכול להיווצר מתוך חוט השדרה בצורת פעילות בדוגמת חשמל 1,3. התפרצויות אלה קצבית מיוצרים הרץ 0.2-0.5 ו - הם בדוגמת ב החילופים משמאל לימין ו-extensor מכופף. בשלבים התפתחותיים שונים, את החוסן ואת דפוסי פעילות זו משתנה 1. מוטציות גנטיות יכול גם להפריע דפוסים של פעילות זו 3,5,7. מחקרים טראנסגנטי והתפתחותית פעילות זו לספק תובנות הארגון של המעגלים דפוס מרכזי ביצירת ולהודיע מחקרים של ההתפתחות העצבית, בדרך כלל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
סמואל ל Pfaff הוא פרופסור במעבדות ביטוי גנים במכון סאלק למחקרים ביולוגיים החוקר את הווארד יוז רפואי במכון. עבודה זו נתמכה על ידי כריסטופר ודנה ריב קרן. ג'ו Belcovson, קנט Schnoeker ומייק סאליבן ב משאבי מולטימדיה במכון סאלק סיוע בצילום ועריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. , (2010).
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
