Summary
신생아 설치류 척추 코드의 electrophysiological 녹음을 측정하는 데 사용되는 세포 흡입 전극의 제조 및 사용의 데모
Abstract
신경 circuitries와 운동의 발전은 신생아 쥐 척수 중앙 패턴 발생기 (CPG) 동작을 이용하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 해부 쥐 척수 코드에서 흡입 CPG 활동을 검사하는 데 사용되는 전극, 또는 상상의 운동을 조작하는 방법을 보여줍니다. 설치류 척추 코드는 인공 뇌척수에 배치되고 복부 뿌리는 흡입 전극으로 그려져있다. 전극은 상용 흡입 전극을 수정하여 구성되어 있습니다. 무거운 은색 와이어는 상용 전극에 의해 주어진 표준 와이어 대신 사용됩니다. 상업 전극에 유리 팁은 증가 내구성 플라스틱 팁로 대체됩니다. 우리는 일관성과 재현성있게, 튜빙의 특정 크기로 만들어진 손으로 그린 전극과 전극을 준비합니다. 데이터는 증폭기 및 neurogram 수집 소프트웨어를 사용하여 수집됩니다. 각각, 기계 및 전기 간섭을 방지하기 위해 녹음은 패러데이 케이지 내에서 공기 테이블에 수행됩니다.
Protocol
절연 척추 코드의 Electrophysiological 녹음 신경 회로 1 유전자 및 개발 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 우리는 이전에 신생아 마우스 척추 코드 2을 해부하다하는 방법을 보여주었다. 여기 우리는 고립 척추 코드 3 상상의 운동을 기록에 유용 흡입 전극을 준비하는 방법을 제시한다.
플라스틱 튜브 전극의 끝은 저온 알코올 램프 3-5 사용 손으로 아주 좋은 팁을 그립 수 있습니다. 플라스틱 관 (PE90, 클레이 애덤스 Intramedic TM)는 가단 형태로 튜브를 부드럽게하기 위해 화염을 통해 실시하고 있습니다. 튜브가 녹기 시작하고 더 투명 해짐에 따라 그것은 열원과 종료가 부드럽게 떨어져 행진에서 제거됩니다. 불꽃에서 튜브를 제거하는시기는 플라스틱이 붕괴하거나 그려하면서 분할하지 않습니다 확보하는 것이 중요합니다. 튜빙의 얇은 부분은 원하는 내경에 따라 면도날로 절단 등 표본이나 코드의 segmental 수준의 나이에 의해 결정. 튜브에 O - 링을 배치의 용이성을 위해, 45 ° 삭감은 면도날로 튜브의 두께 끝에 이루어집니다. 물미 및 O - 링은 전극의 배럴당 전극 팁을 첨부하기 위해 두꺼운 끝에 설치되어 있습니다.
특히 중소 전극에 대한 허용의 어려움 피하려면 손을 당기는 전극 팁, 전극은 두꺼운 튜브 (PE90)에 삽입 작은 튜브를 사용하여 건설 수 있습니다. 튜브의 길이는 녹화 설정의 요구 사항을 특정하고 변수입니다. 우리는 실험 1-3,5에 사용되는 측정을 제시한다. PTFE 미세 관 (제우스, 소형 부품) 및 PE90 튜브의 10cm 길이 1cm 길이는 면도날로 절단됩니다. 작은 튜브의 끝을들은이 조각 또는 폐쇄되지 않도록하는 검사해야합니다. 그들은 곤충 핀 (파인 과학 도구)를 사용하여 열 수 있습니다. 접착제 (JB 용접)의 드롭은 PTFE 튜빙의 미드에 배치됩니다. PTFE 튜빙과 접착제는 PE90 튜브에 입 흡입을 사용하여 PE90 튜브로 그려져 있습니다. 45 ° 컷은 튜브의 두께 끝에 만들어진이며 물미 및 O - 링은 같은 이전, 첨부합니다.
물미 및 BNC 커넥터는 상업 흡입 전극에서 unscrewed 있습니다. BNC 커넥터는 왁스 봉인을 제거 한 시간 크실렌에 배어있다. 커넥터는 다음 물로 씻어서 건조합니다.
낮은 직각 사이드 포트 통의 측면에하셔야합니다. 금속 막대는 알콜 램프를 사용하여 가열하고 낮은 각도로 통의 측면에있는 기존 구멍에 누르면됩니다. 0.010 인치 실버 와이어 (AM 시스템)의 15cm 길이를 15 분 동안 잘라 표백제에 배어있다. 이것은 신호 전도 6 에이즈되는 은색 염화물 코팅을 만들 수 이루어집니다. 와이어는 물로 씻어서 건조하고, BNC 커넥터에 다음 납땜합니다. BNC 커넥터와 실버 와이어는 통의 측면을 유지하기 위해 BNC 커넥터에 대한 충분한 공간과 흡입 전극 배럴에 삽입됩니다. 흡입 튜브는 사이드 포트 2-3cm에 삽입됩니다. 실리콘 밀봉제는 배럴당 약 2-3cm로 주입됩니다. BNC 커넥터는 앞으로 밀봉 재를 밀어 전극의 총구에 스레드입니다.
전극의 팁 이제 전극의 프런트 엔드로 스레드입니다. 축소 관은 또한 측면 포트의 흡입 라인을 강화하기 위해 추가할 수 있습니다.
전극 자기 서에 첨부하고, 녹음 요리 근처에 배치 micromanipulators에 탑재하고 있습니다. BNC 동축 케이블은 앰프에 설치된 headstage에 첨부됩니다. 증폭기는 데이터 수집 소프트웨어 (Polyview)와 PC의 컴퓨터에 디지털 카드에 아날로그 (국가 악기)에 연결된 어댑터 (Polyview)에 연결되어 있습니다.
electrophysiological 데이터를 기록하면, 모든 외부 간섭을 제거하기 위해 필요합니다. 각각, 전기 및 기계적 간섭을 방지하기 위해 녹음 요리, 증폭기, 그리고 머리 단계는 패러데이 케이지 내에서 공기 테이블에 배치됩니다.
대표 결과 :
그림은 1. 상용 흡입 전극은 알콜 램프에 그려져, 또는 특정 크기의 상용 플라스틱 튜브와 건설 무거운 게이지 실버 와이어 손으로하는 플라스틱 팁을 추가하여 수정할 수 있습니다. 또한, 파라핀의 밀봉제 더 내구성이 실리콘 편자에 박는 뾰족한 징을 박다 밀봉제로 대체됩니다.
그림 2. 공기 테이블과 관련하여 흡입 전극의 구조 (기계 격리를 위해), 패러데이 케이지 (전기 isolati)에 앰프 및 컴퓨터. 이것은 공기 테이블과 패러데이 케이지에 참조된 기록 요리와 두 번째 접지 참조 지상이있다는 것을 주목하여야한다.
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Discussion
신경 시스템 개발은 격리 쥐 척수 코드를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 신경 전달 물질의 존재에 상상의 운동은 패턴 전기 활동을 1,3의 형태로 척수에서 생성할 수 있습니다. 이러한 리듬 파열은 0.2-0.5 Hz에서에서 생산하고 왼쪽, 오른쪽과 flexor - 신근 alternations에서 패턴입니다. 다른 발달 단계에,이 활동의 견고하고 패턴 1 다릅니다. 유전자 변이는 또한이 활동을 3,5,7의 patterning을 방해하실 수 있습니다. 이 활동의 유전자 변형과 발달 연구는 중앙 패턴 생성 회로의 조직에 대한 통찰력을 제공하며 일반적으로 신경 발달의 연구를 알려줍니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
사무엘 L. 파프는 생물 학적 연구 솔크 연구소에서 유전자 발현 연구소에서 교수와 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다. 이 작품은 크리스토퍼와 다나 리브 재단에 의해 지원되었다. 조 Belcovson, 켄트 Schnoeker와 솔크 연구소에서 멀티미디어 자원에 마이크 설리반은 사진 촬영 및 편집 지원을 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
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