Summary
Una dimostrazione della fabbricazione e l'uso di un elettrodo extracellulare di aspirazione utilizzata per misurare le registrazioni elettrofisiologiche delle corde roditori neonatale vertebrale
Abstract
Sviluppo della circuiteria neurale e locomozione possono essere studiate usando neonatale roditori midollo spinale centrale pattern generator (CPG) comportamento. Dimostriamo un metodo per fabbricare elettrodi di aspirazione che sono utilizzati per esaminare l'attività CPG, o locomozione fittizia, in cordoni roditori sezionato spinale. I cavi roditori spinale sono posti in artificiale liquido cerebrospinale e le radici ventrali sono trascinati nella elettrodo di aspirazione. L'elettrodo è costruito modificando un elettrodo di aspirazione disponibile in commercio. Un filo d'argento pesante viene usato al posto del filo standard assegnato da l'elettrodo disponibili in commercio. La punta di vetro sull'elettrodo commerciale viene sostituito con una punta di plastica per una maggiore durata. Prepariamo mano elettrodi disegnate e elettrodi in dimensioni specifiche di tubi, permettendo coerenza e riproducibilità. I dati vengono raccolti con un amplificatore e acquisizione di software neurogram. Le registrazioni vengono effettuate su un tavolo d'aria all'interno di una gabbia di Faraday per evitare interferenze meccaniche ed elettriche, rispettivamente.
Protocol
Le registrazioni elettrofisiologiche di isolati midollo spinale può rivelare cambiamenti genetici e di sviluppo di circuiti neurali 1. Abbiamo già dimostrato un metodo per analizzare i cavi del mouse neonatale vertebrale 2. Qui vi presentiamo un metodo per preparare elettrodi aspirazione utile nella registrazione locomozione fittizia nel midollo spinale isolato 3.
La punta di un elettrodo di tubi di plastica può essere attratto da una punta molto sottile a mano utilizzando una lampada a bassa temperatura alcool 3-5. Il tubo di plastica (PE90, Clay Adams Intramedic TM) si tiene sopra la fiamma per ammorbidire il tubo in una forma malleabile. Come il tubo comincia a sciogliersi e diventa sempre più trasparente non viene rimossa dalla fonte di calore e le estremità sono leggermente separati. I tempi di rimuovere il tubo dal fuoco è importante per assicurare la plastica non collassa o dividere durante la fase di elaborazione. La parte sottile del tubo viene tagliato con una lametta in base al diametro desiderato interno, come dettato dalla età del campione o il livello segmentale del midollo. Per facilità di mettere un o-ring sul tubo, taglio a 45 ° è fatta alla fine di spessore del tubo con una lametta. Una ghiera e o-ring sono installati alla fine di spessore per fissare la punta dell'elettrodo al barile dell'elettrodo.
Per consentire elettrodi specificamente formato ed evitare le difficoltà di mano tirando punte degli elettrodi, gli elettrodi può essere costruito utilizzando un tubo inserito in un piccolo tubo più spesso (PE90). Le lunghezze dei tubi sono specifici per le esigenze del sistema di registrazione e sono variabili. Vi presentiamo le misurazioni utilizzate nei nostri esperimenti 1-3,5. Una lunghezza 1 centimetro di tubo in PTFE fine (Zeus, parti piccole) e una lunghezza di 10 cm di PE90 tubi sono tagliati con una lama di rasoio. Le estremità del tubo piccoli dovrebbero essere esaminate per essere sicuri che non siano schiacciati o chiuse. Essi possono essere aperti con un pin di insetti (Strumenti di scienze arti). Una goccia di colla (JB Weld) è posizionato sul punto medio del tubo in PTFE. Il tubo in PTFE e l'adesivo sono disegnati nel tubo di aspirazione con PE90 bocca sul tubo PE90. Un taglio a 45 ° è fatta alla fine di spessore del tubo e una ghiera e o-ring sono attaccati, come precedente.
Il connettore BNC e puntale sono svitato da un elettrodo di aspirazione commerciale. Il connettore BNC è imbevuta di xilene per un'ora per rimuovere il sigillo di cera. Il connettore è poi risciacquato in acqua ed essiccati.
Una porta lato inferiore angolata deve essere effettuata sul lato della canna. Una barra di metallo viene riscaldata utilizzando un becco Bunsen e pressati nel foro esistente sul lato del barilotto con un angolo basso. Una lunghezza 15cm di filo d'argento 0,010 pollici (AM Systems) viene tagliata e imbevuta di candeggina per quindici minuti. Questo è fatto per creare un rivestimento d'argento cloruro che aiuta nella conduzione del segnale 6. Il filo è risciacquata con acqua, secchi, e poi saldato sul connettore BNC. Il filo connettore BNC e l'argento sono inseriti nella canna di aspirazione elettrodo con abbastanza spazio per il connettore BNC di rimanere al fianco della canna. Tubo di aspirazione è inserita nella porta laterale 2-3cm. Sigillante siliconico viene iniettato nel cilindro di circa 2-3cm. Il connettore BNC è avvitato al barile dell'elettrodo spingendo il sigillante in avanti.
La punta dell'elettrodo è ormai avvitata nella parte anteriore dell'elettrodo. Tubo restringente può anche essere aggiunto per rafforzare la linea di aspirazione dalla porta laterale.
Gli elettrodi sono montati su micromanipolatori che sono collegati a supporti magnetici, e posto vicino al piatto di registrazione. BNC cavi coassiali sono collegate ad un headstage che è collegato ad un amplificatore. L'amplificatore è collegato ad un adattatore (Polyview) che è collegato ad una scheda analogica a digitale (National Instruments) in un computer PC con software di acquisizione dati (Polyview).
Durante la registrazione di dati elettrofisiologici, è necessario eliminare tutte le interferenze esterne. Il piatto di registrazione, amplificatore e stadio testa sono collocati su un tavolo d'aria all'interno di una gabbia di Faraday per evitare interferenze elettriche e meccaniche, rispettivamente.
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Un elettrodo di aspirazione disponibili in commercio possono essere modificati con l'aggiunta di un filo d'argento pesante calibro e una punta di plastica che viene disegnato a mano su una lampada ad alcool, o costruito con tubi di plastica in commercio di dimensioni specifiche. Inoltre, il sigillante paraffina viene sostituito con più durevole mastice sigillante siliconico.
Figura 2. Una schematica degli elettrodi di aspirazione in relazione al tavolo d'aria (per l'isolamento meccanico), gabbia di Faraday (elettrici isolativia), amplificatore e il computer. Va notato che c'è una massa di riferimento per il piatto di registrazione e un secondo motivo che fa riferimento alla tabella aria e gabbia di Faraday.
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Discussion
Sviluppo del sistema nervoso possono essere studiate usando cavi isolati spinale di roditori. In presenza di neurotrasmettitori, locomozione fittizia possono essere generati dal midollo spinale sotto forma di attività elettrica fantasia 1,3. Queste esplosioni ritmiche sono prodotti a 0,2-0,5 Hz e sono modellati in alternanza destra-sinistra e flessori-estensori. A diversi stadi di sviluppo, la robustezza ed i modelli di questa attività varia a 1. Mutazioni genetiche possono anche disturbare il modello di questa attività 3,5,7. Studi transgenici e di sviluppo di questa attività consentono di farsi un'idea l'organizzazione di circuiti modello centrale generazione e informare gli studi di sviluppo neurale, in generale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff è docente nei Laboratori di espressione genica presso il Salk Institute for Biological Studies e un investigatore della Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dal Christopher e Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan in Risorse Multimediale presso il Salk Institute ha fornito assistenza con la fotografia e montaggio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
