수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
관상 심장 질환은 epidemiologically과 fiscally 중요한 공중 보건 문제가되고 있습니다. 상당한 기초 연구는 아직 부상과 개조를 진행하는 메커니즘과 방법들이 임상 사용하기 위해 개발해야하는 경우 잠재적인 치료제가 이러한 프로세스를 조절 수 있습니다 이해가 필요합니다. 설치류는 가장 일반적으로 사용 가능한 유전자 변형 생쥐의 다양한 수종이 더 매력적인 모델을 만들 수 있습니다.
마우스와 다른 종 사이의 차이가 있지만, murine 모델에 많은 장점이 있습니다. 간단한 해부 범위 또는 돋보기의 사용을 잘 조명 조건 vasculature가 쉽게 (vasculature에 대한 자세한 총 해부학에 대한, 살토 – 텔레 즈 외 참조하십시오., 2004 13) 볼 수 있습니다. 25g 마우스의 총 혈액 볼륨 미만 2ml 14 년부터 이후 수술 사망률의 위험을 줄이기 위해서는 대형 선박을 severing 피하기 위해 매우 중요합니다. 과도한 출혈이 발생하는 경우, 압력이나 정확하게의 소작의 부드러운 응용 프로그램은 출혈을 멈추게하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차는 또한 다양한 방법으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스는 isoflurane, 마취제 / xylazine, 또는 나트륨 pentobarbital하고 적절한 선택이 프로토콜 15-18 기간에 의해 결정됩니다를 사용하여 anesthetized 수 있습니다. 발가락 – 핀치 반사는 마취의 깊이에서 가장 일반적으로 사용되는 인덱스입니다. 또한, 장기적인 생존 가능성을 향상시키기 위해, 몇 가지 조사가 치명적인 arrhythmias 19,20 그러나이 최근 급성에서 antiapoptotic 속성을 가지고 표시되었는지 고려해야한다의 발생을 줄이기 위해 같은 lidocaine과 같은 antiarrhythmic 약물을 사용 모델 21. 또한, 포스트 수술 고통을 줄이기 위해 같은 buprenorphine과 같은 진통제는 수술 3,16,17,22,23 후 첫 48 시간 시행하실 수 있습니다. 수술 중 체온을 (특히 이상 프로토콜)을 유지하기 위해 가열 패드와 시리즈의 직장 프로브은 종종 등온 패드 대신 사용됩니다. 영구 폐색 들어, 경색의 크기는 묶인의 위치를 조정하여 수정할 수 있습니다,, 폐색 (S)과 reperfusion (S) 기간은 변경될 수 있습니다 국소 빈혈 / reperfusion 및 / 또는 허혈성 사전 또는 postconditioning에 대한 그리고 intramyocardial 주사 (예 : 세포, 단백질)를, 1-3 주입 위치가있을 수 있으며, 사출 당 볼륨을 15 μl 24까지 수 있습니다. 세포가 주입되는 경우, 바늘의 게이지는 바늘의 내부 직경이 쉬어링 피할 정도로 큰되도록 5,25,26는 세포의 크기에 따라 선택한다 (일반적으로 26-30) 사용됩니다. 수술에 의해 발생한 염증 과정으로 인해 confounds을 피하기 위해, 일부 조사는 수술 후 27-29 어느 시점 닫힌 가슴 마우스의 마음을 막다하고 reperfuse 전 (前) 생체내을 조작하는 올무를 사용하여보고있다. 최근 가오 외. 30 임시 및 영구 폐색이 통풍을위한 필요없이 수행할 수 있으며 몇 연구소가 폐쇄 가슴 intramyocardial 주사 25,31을 수행하기 위해 초음파를 사용하여 시작하는 것으로 나타났습니다.
생쥐에서 관상 동맥을 ligating의 가능성을 보여주는 첫 연구가 1954 32 존스와 올슨에 의해 출판 되었음 때문에, 많은 사람들이이 모델을 채택하고 심근 상해 및 리모델링 3,33-45의 다양한 측면을 연구하기 위해 그것을 수정했습니다. 크기, 생식 능력과 구매 및 유지 보수에 대한 비교적 적은 비용의 관점에서 생쥐의 성격이 종에게 physiologic과 pathophysiologic 연구 광범위한 매력적인 도구를합니다. 생체내의 진보 46-49의 이미징을위한 기술의 소형화뿐만 아니라이 수행하고 대규모 게놈과 proteomics, 약물 검사, 세포 기반 및 / 또는 단백질 요법의 효능뿐만 아니라 결합 biomaterials 50-64을 분석하는 수단으로 유비 쿼터스 또는 조직 특정 유전자 변형이나 돌연변이 / 녹아웃 마우스에서 유전자 조작 여유의 점점 다양한, 심근 경색의 murine 모델은 의심의 여지없이 급성 심장 부상 장기적인 리모델링을 평가에 귀중한 도구가 될 것입니다. 따라서, 안정 reproducibly 이러한 실험을 수행할 수있는에 나무랄 데없는 가치가있다.
The authors have nothing to disclose.
난 그들의 경계와 도움을 비교 의학 연구 및 부서를 지원하기 위해 기금을 제공하는 연구 및 졸업 연구학과를 인정하고 싶습니다. 나는 또한 그들의 도움을 그들의 지원과지도에 대한 생리학의학과뿐만 아니라, 내 연구실에서 학생과 기술자를 인식하고 싶습니다. 마지막으로, 내가 마우스 미세을 알게되는 시간 동안 교육 기회에 대한 내 포스트 박사 멘토, 닥터 찰스 E. 머리를 감사하고 싶습니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |