Con tutto il supporto per l'analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Summary

Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l'etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.

Abstract

Tutto-mount analisi immunoistochimica per l'imaging la vascolarizzazione intera è fondamentale per la comprensione dei meccanismi cellulari di ramificazione morfogenesi. Abbiamo sviluppato la pelle modello vascolarizzazione degli arti per lo studio dello sviluppo vascolare in cui viene riorganizzato un preesistente primitivo plesso capillare in una rete ramificata gerarchicamente vascolare. Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura più permette l'imaging con robusto dei vasi sanguigni intatti così come i loro componenti cellulari, comprese le cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce, utilizzando specifici marcatori fluorescenti. I progressi in questo modello vascolarizzazione della pelle degli arti con studi genetici hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari di sviluppo vascolare e patterning. La pelle modello vascolarizzazione degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici fornire un modello spaziale per la differenziazione ed il modello delle arterie. In questo articolo video descrive un protocollo semplice e robusto per colorare i vasi sanguigni intatti vascolare con anticorpi specifici e anticorpi secondari fluorescenti, che è applicabile per vascolarizzato organi embrionali dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare.

Protocol

1. La raccolta degli arti pelle embrionali di topo (~ E13.5 E17.5)

1. Euthanize collegato femmine con procedura approvata. Secondo il nostro protocollo animali approvati, le femmine sono eutanasia da CO ₂ l'esposizione e poi assicurata dalla dislocazione cervicale. Giaceva l'animale al tovagliolo di carta assorbente e immergerlo completamente nel 70% EtOH / H ₂ O da una bottiglia a spruzzo.
2. Sezionare l'utero intatto e mettetelo in un piatto da 100 mm x 15 Petri contenenti soluzione equilibrata Salt ghiacciata Hanks '(HBSS) per lavare nel sangue.
3. Separati e sezionare l'embrione. Rimuovere il amnios molto sottile dall'embrione.
4. (Opzione) Dissect un singolo embrione in un piatto x 35 10 millimetri Petri se ogni embrione deve essere genotipizzati. Coda sezionato viene trasferito in un tubo da 0,2 ml PCR per la genotipizzazione.
5. Tagliare le zampe anteriori di embrione ed il trasferimento arti anteriori da una pinza l'anello in 24 pozzetti contenenti 2 ml di ghiacciata paraformaldeide fresca 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS).
6. Fissare le zampe anteriori con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte.
7. Il giorno seguente, togliere la PFA e lavare tre volte per 5 min in 2 ml di PBS con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente.
8. Trasferimento degli arti anteriori in 100% di metanolo (MeOH) e memorizzarli congelatore a -20 ° C enzima (il congelatore con controllo della temperatura critica e senza funzione di sbrinamento automatico). Anticorpi primari indicati nella tabella 1 lavoro dopo il trattamento MeOH 100%.
9. Pelle a buccia fuori dalla zampa anteriore con una pinzetta sottile. Cutanee degli arti, quando disidratato, dovrebbe separare facilmente dal arto. In primo luogo l'arto con il lato ventrale (lato palmo) verso l'alto. Quindi, utilizzando una pinzetta sottile, tagliare la pelle, come mostrato nel video. Avanti sezionare intorno tutto l'arto, desquamazione della pelle fuori delicatamente senza alcun danno.

2. Tutto-mount la colorazione immunoistochimica di Skins Limb

1. Reidratare le pelli arto in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo incubando attraverso la serie graduata di MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) per 5 minuti ciascuno. Si noti che lo scambio di soluzioni dovrebbero fare attenzione a non danneggiare le bucce degli arti.
2. Lavare due volte per 5 min in PBT con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente.
3. Bloccare le pelli di capra arto o con 10% di siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi di capra secondario o al 10% Donkey siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi asino secondaria di 2 ore con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a a temperatura ambiente.
4. Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi primari (diluizione appropriato tra quelli riportati nelle tabelle) nel tampone di bloccaggio (o di capra 10% di siero / PBS 0,2 TX100% o 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Incubare le pelli arto con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte. Si noti che più gli anticorpi primari derivati ​​da specie diverse (ad esempio, anticorpo monoclonale di ratto + anticorpo policlonale di coniglio) possono essere utilizzati contemporaneamente.
5. Il giorno seguente, posizionare le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS +0,2% TX100 o 2 Donkey% siero / PBS TX100 +0,2%).
6. Lavare cinque volte per 15 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente.
7. Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi secondari nel buffer di blocco (o 10% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o al 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Di solito si usa anticorpi secondari da Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, diluizioni 1:300) o Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluizione). Filtrare la soluzione secondaria di anticorpi utilizzando 0.22μm PVDF filtri a membrana siringa per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari. Incubare le bucce arto al buio o avvolti con fogli di alluminio per 1 ora mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che diversi fluorescente anticorpi coniugati secondari derivati ​​da specie diverse possono essere utilizzati contemporaneamente.
8. Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS +0,2% TX100). Lavare cinque volte per 15 minuti al buio o avvolti in fogli di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente.
9. (Opzione per la contro-contro nucleo) Incubare le pelli degli arti con 4 ml di tampone di lavaggio (sia Capra 2% siero / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), con A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , diluizione 1:3000) al buio o avvolti con fogli di alluminio per 10 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura temperare. Poi, lavare tre volte per 5 min con 4ml del buffer di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), al buio o avvolta da un foglio di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che la colorazione forte e specifico per i nuclei si osserva per To-pro-3 in una emissione specifica (HeNe 633 nm di eccitazione).

3. Montaggio del Skins Limb su Slide

1. Mettere le bucce arto su un piatto x 35 10 millimetri Petri. Rimuovere polveri, cristalli, fibre dallo strato interno della pelle con una pinzetta sottile con lo stereomicroscopio, con illuminazione bassa per evitare foto esteso sbiancamento.
2. Trasferire le pelli arto per adesivo microscopio da una pinza ad anello. Posizionare le bucce con lo strato interno disteso verso l'alto della diapositiva (cioè verso coprioggetto). Appiattire la pelle accuratamente con una pinzetta sottile e rimuovere riporto il tampone di lavaggio da Kimwipe.
3. Montare in supporti di montaggio anti-sbiadimento senza bolle d'aria. Utilizziamo 25 coprioggetto "x25". Cure su una superficie piana al buio (per esempio, i campioni montato utilizzando Prolungare reagente oro sono poste una notte al buio a temperatura ambiente prima linea). Per la conservazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto alla diapositiva e conservare a 4 ° C.

4. Microscopia confocale

1. Impostare laser appropriato per fluorofori. Noi usiamo microscopio confocale Leica TCS SP5 con tre sorgenti laser compresa Argon 488 nm (per Alexa Fluor 488 e GFP), DPSS 561nm (per Alexa Fluor 568 e Cy3) e HeNe 633nm (per Alexa Fluor 633, Cy5 e To-Pro-3) .
2. Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale per evitare o ridurre le interferenze, in cui tutti i coloranti in campioni di doppia o tripla macchiati saranno entusiasti al tempo stesso. Nella modalità di scansione sequenziale, le immagini verranno registrate in ordine sequenziale.
3. Altre informazioni relative al coloranti fluorescenti e laser per l'eccitazione può essere fondata in "Microscopia confocale per biologi" di Hibbs (2004)

5. Rappresentante Risultati

Tutto-mount microscopia confocale tripla etichetta immnofluorescence in pelle di topo anteriore al E15.5 con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (Fig. 1A-C, D blu), il marker neurofilamenti 2H3 (Figura 1A verde), e le cellule muscolari lisce marcatore αSMA (Figura 1A, B rossa) ha rivelato un quadro caratteristico di ramificazione di αSMA arterie ^+, in linea con 2H3 ⁺ nervi periferici nella pelle degli arti. Oltre al vaso sanguigno ramificazione, questa skin modello vascolarizzazione degli arti vengono usati per studiare patterning di vasi linfatici branching tramite anticorpi per il marcatore delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (Figura 1D, E rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ).

Figura 1. (AC) Arterie allinearsi con i nervi periferici nella pelle degli arti embrionali. Tutto-mount tripla etichetta microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (AC, blu), il marker neurofilamenti 2H3 (A, verde), e il buon marker delle cellule muscolari αSMA (A e B, rosso ) viene visualizzato. A E15.5, 2H3 ⁺ nervi periferici (frecce aperte) associare arterie (punte di freccia), che sono coperti da αSMA ⁺ cellule muscolari lisce. (DF) vasi linfatici nella pelle degli arti embrionali. Triple-label microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (D, blu), il marker delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (D ed E, rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) viene visualizzato. Vasi linfatici sono visualizzate da entrambi LYVE-1 e NRP2, mentre LYVE-1 è espressa anche da un sottoinsieme di macrofagi (punte di freccia aperta). Scala grafica: 100μm.

Discussion

Il sistema vascolare è fondamentale per lo sviluppo degli organi durante l'embriogenesi, nonché per la manutenzione degli organi e delle funzioni riproduttive negli adulti, in quanto fornisce sufficiente ossigeno e nutrienti agli organi. Adeguata rete vascolare è ben stabilita con processi complessi e multi-passo per l'angiogenesi in cui viene riorganizzato pre-esistente rete capillare di strutture fortemente ramificate e gerarchica. Sebbene numerose opere sono state dimostrato che una varietà di molecole è coinvolto in questi processi, non è stato chiaro come gli organi o dei loro componenti forniscono i segnali di promuovere il processo graduale di sviluppo vascolare quali la differenziazione endoteliale vascolare ed il modello di ramificazione. Per rispondere a questa domanda, appropriati organi vascolarizzati dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare sono obbligatori. La pelle modello vascolarizzazione degli arti con guadagno di funzione e la perdita di funzione manipolazioni genetiche ad alta risoluzione consente di analisi dello sviluppo vascolare.

Descriviamo qui un protocollo dettagliato compresa la dissezione di arti anteriori embrionali di topo, con tutto il montaggio colorazione immunoistochimica e la microscopia confocale che viene utilizzato di routine nel nostro laboratorio per l'analisi della pelle degli arti e la linfoangiogenesi angiogenesi. Il protocollo fornisce risultati riproducibili e vasi intatti per l'inizio e fine della pelle degli arti embrionale può essere facilmente immaginato da microscopia confocale. E 'applicabile anche per gli adulti orecchio vascolarizzazione della pelle (YM e K. Perkins, inedito). Per esplorare ulteriormente l'immagine della dinamica di crescita dei vasi sanguigni e il rimodellamento, tuttavia, il modello animale come pesce zebra con i vasi sanguigni fluorescente è utile per i time-lapse imaging del sistema vascolare in vivo ad alta risoluzione.

Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura multipli marcatori vascolari ci ha permesso di sangue l'immagine e le cellule endoteliali linfatiche, ei loro vicini, comprese le cellule muscolari lisce e periciti nelle bucce. Oltre agli anticorpi marker vascolari (Tabella 2), gli anticorpi per i prodotti gene reporter (proteina β-galattosidasi, β-gal e verde fluorescente, GFP, tabella 2) che riassumono il pattern di espressione di geni endogeni di tuo interesse possono essere utilizzati. Per esempio, abbiamo utilizzato la pelle degli arti anteriori da embrioni aventi giornalista lacZ mirati al ephrinB2 (Wang et al., 1998) o EphB4 locus (Gerety et al., 1999), che fornisce un indicatore di istochimica ephrinB2 o EphB4. EphrinB2, un legante transmembrana, è espressa da arterie, ma non le vene, mentre il suo recettore, il EphB4 della tirosin-chinasi è preferenzialmente espresso da vene (Wang et al., 1998). Tutto-mount analisi immunoistochimica di pelli forelimb di E15.5 ephrinB2 ^{lacZ / +} o EphB4 ^{lacZ /} embrioni ⁺ eterozigote ha rivelato che i nervi periferici sensoriali associati preferenzialmente con vasi arteriosi (Mukouyama et al. 2002). Questi topi sono disponibili presso il Laboratorio Jackson (Efnb2 ^tm1And / J: stock # 006039, Ephb4 ^tm1And / J: stock # 006044).

Lo studio delle diverse fasi di questi sistemi vascolare rivela la dinamica dei cellulari tra cui l'angiogenesi vascolare ramificazione, arterioso / venoso differenziazione, lo sviluppo dei vasi linfatici e della muscolatura liscia / periciti copertura nella pelle degli arti via di sviluppo. Da E13.5, primitivo capillare plesso è stato stabilito nella pelle degli arti ma nessuna associazione tra i nervi sensoriali e vasi sanguigni, è stata osservata. Da E14.5, rimodellamento vascolare si è verificato e neuropatico associato all'infezione da ristrutturato vasi ramificati, che esprimono i marcatori delle cellule endoteliali arteriose e hanno αSMA ⁺ cellule muscolari lisce (Mukouyama et al. 2002). Studi genetici suggeriscono che i nervi periferici sensitivi forniscono un modello per determinare gli schemi dei vasi sanguigni di ramificazione e la differenziazione delle arterie (Mukouyama et al. 2002). L'analisi del nervo-VEGF-A mutanti condizionale rivelato che nervose derivate VEGF-A è necessario per la differenziazione delle arterie degli arti pelle vascolare (Mukouyama et al. 2005). I nostri risultati hanno anche mostrato che il nervo-VEGF-A mutanti condizionali mostra meno compromissione del nervo-nave di allineamento, che indica il coinvolgimento di ulteriori fattori angiogenici (s). Questo suggerisce che la pelle modello vascolarizzazione dell'arto ci permette di studiare diversi meccanismi che controllano la differenziazione delle arterie ed il modello di ramificazione vascolare. Inoltre, ciò che controlla la differenziazione venosa ed il modello di vaso venoso e linfatico ramificazione rimane ancora una risposta.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.