Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.
Todo-mount análise imunohistoquímica para a imagem latente toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares de ramificação morfogênese. Nós desenvolvemos o membro modelo vascularização da pele para estudar o desenvolvimento vascular em que um pré-existentes primitiva do plexo capilar é reorganizado em uma rede hierarquicamente ramificada vascular. Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos permite imagem robusta dos vasos sanguíneos intacta, assim como seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, usando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo vasculatura membro pele com estudos genéticos têm melhorado a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular e padronização. O membro modelo vasculatura da pele tem sido usada para estudar como os nervos periféricos fornecer um modelo espacial para a diferenciação e padronização das artérias. Este artigo descreve um protocolo de vídeo simples e robusto para corar vasos sanguíneos vascular intacto com anticorpos específicos e fluorescentes anticorpos secundários, que é aplicável para os órgãos vascularizados embrionárias, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.
O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas es…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a K. Gill para a assistência com a criação do mouse e os cuidados e para a gestão de laboratório. Agradeço também aos membros Mukoyama laboratório para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos de Saúde Naitonal.
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.