Summary
אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים
Abstract
בדומה tumerfaciens Agrobacterium, rhizogenes Agrobacterium יכול להעביר DNAs זרים לתוך בתאי צמח על בסיס אוטונומי שורש וישכנע (הר"י) פלסמיד א. rhizogenes יכול לגרום להיווצרות שורש שעיר על רקמות הצמח צורה צמחים מורכבים לאחר השינוי. על הצמחים האלה מורכבים, כמה שורשים מחדש הם מהונדס, נושאת את סוג בר T-DNA ואת וקטור בינארי מהונדסים, בעוד יורה עדיין לא מהונדס, המשמש על מנת לספק אנרגיה לתמוך בצמיחה. אלו צמחים שורש שעיר מרוכבים לא ייצרו זרעים מהונדס, אך יש מספר תכונות חשובות ההופכות את הצמחים האלה מורכב מאוד שימושי מחקר הצמח. ראשית, עם מגוון רחב מארח, א rhizogenes יכול להפוך מיני צמחים רבים, במיוחד dicots, המאפשר הנדסה גנטית במגוון רחב של מינים. שנית, א rhizogenes להדביק רקמות explants ישירות; לא בתרביות רקמה לפני השינוי הוא הכרחי כדי להשיג צמחים מורכבים, מה שהופך אותם אידיאליים עבור הפיכת מיני הצמחים הסוררים. יתר על כן, רקמות השורש מהונדס יכול להיווצר בתוך כמה שבועות. עבור Medicago truncatula, אנחנו יכולים להשיג שורשים מהונדס ב קצר ככל שלושה שבועות, מהר יותר מאשר שינוי נורמלי לטבול פרחים ארבידופסיס. בסך הכל, שורש שעיר המשולב בטכנולוגיה הצמח כלי תכליתי ושימושי ללמוד פונקציות גנים הקשורים שורש-פנוטיפים. כאן אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים מ truncatula.
Protocol
פרוטוקול הבאים נעשה שימוש כדי ליצור צמחים שורש שעיר מורכב קטניות מודל מינים מ truncatula. פרוטוקולים דומים הותאמו לפחות שמונה מיני צמחים 1-4. השתמשנו מ צמחים truncatula שורש שעיר מרוכבים ללמוד פונקציות גנים שורש ופיתוח גולה. הפרוטוקול היה מופרד לארבעה חלקים: 1) חומרי plant בהכנת; 2) יצירת צמחים שורש שעיר מרוכבים: 3) הסימביוטי זיהום Rhizobia, ו 4) זיהוי שורש מהונדס. השתמשנו וקטור בינארי המכיל גן ירוק ניאון (GFP) חלבון ככתב להקרנה שורש מהונדס בצמחים מורכבים 3. בהשוואה מבחר אנטיביוטיקה מבוססת, GFP מבוססי ההקרנה היא מהירה, קלה וזולה. ב לבנות שלנו, ER-ביטוי ממוטב את הגן GFP הוא מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין סופר, אשר חזקה אותות ה-GFP מכונן שורשי מהונדס, המאפשר הבחנה קלה בין השורשים מהונדס ולא מהונדס.
1. הכנת חומרים Plant
- מ 'זרעים truncautla נקצרים מצמחים הגדלים בחממה (לחות יחסית 50%, 16 / 8 שעות אור / חושך, 22/18 ° C יום / לילה טמפרטורה). זרעים מבוגרים ניתן לאחסן 4 ° C.
- כ -100 זרעים הם התחוח של 10 מ"ל חומצה גופרתית מרוכזת (95-98%, סיגמא אולדריץ, MO) במשך 10 דקות עם רעד תקופתיות.
- הזרעים הם שטופים 5-7 פעמים עם מים סטריליים עם תסיסה עדינה.
- הזרעים הם ספוג אז בטמפרטורת החדר במים במשך 6 שעות וכל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 36-48 שעות כדי לסנכרן נביטה.
- כ 20-30 זרעים מפוזרים על ניירות מסנן לחות להציב בצלחת פטרי. הם שמרו על 22 מעלות צלזיוס, עם 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 40 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור, עבור 5-6 ימים.
- שתילים מונבטים מועברים לתוך האדמה והניח בחממה במשך חודש.
2. יצירת צמחים שעירים שורש מרוכב
- בונה בינארי נושאים גנים של עניין הפכו א rhizogenes באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. יש לנו מהונדסים קבוצה של וקטורים בינארי המכיל את הגן GFP כסמן המאפשרים הקרנת רקמות מהונדס. וקטורים אלו מכילים מקדמי שונים ולכולם יש שיבוט Gateway אתרים (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לביטוי מעל או השתקה של גנים ממוקד 3,5.
- Rhizogenes א 'בתרבית בינוני 50 מ"ל LB עם מבחר אנטיביוטי מתאים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
- חיידקים נאספים מחדש מושעה לריכוז סופי של OD 600 = 0.3 פתרון ללא חנקן מזין הצמח (טבלה 1 ו 6).
- כדי לתמוך התחדשות שורש שעיר, מטריצה תמיכה מעוקר ("צמר סלעים", Hummert הבינלאומי, כדור הארץ סיטי, מיזורי) הוא חתך לתוך התקעים של כ 3 ס"מ 3. אנחנו מקום 4 plugs לתוך צלחת פטרי אחת.
- החור הוא שירבב על גבי תקע כל משתמש קצה פיפטה כדי להקל על הכניסה של explants א. rhizogenes (5 מ"ל) הוא הוסיף לחבר כל אחד.
- קטע לירות עם 2-3 בלוטות בבית השחי הוא נכרת על ידי חתך אלכסוני. Explant מוכנס מכן לתוך התקע, גדל ב 22 מעלות צלזיוס למשך כשלושה שבועות. אנחנו שומרים explants Medicago ללא השקיה עבור 10 הימים הראשונים, ולאחר מכן, מים להם פתרון 5 מ"ל חנקן חופשי בעת הצורך. מצאנו כי הסרת meristem apical עשוי להפחית את היווצרות שורשים adventitious.
3. הסימביוטי Rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) זיהום
- אחרי שלושה שבועות, כמה שורשים adventitious תצא מן צמר הסלע. צמחים שורש שעיר מרוכבים מועברים חול או vermiculite (עיקור), עם או בלי צמר הסלע. הם גדלו בחממה ב 22 ° C, 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 300 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור למשך שבוע נוסף.
- לפני rhizobia זיהום, ש meliloti 1201 הוא בתרבית תמצית שמרים, מניטול 50 מ"ל בינוני למשך 7 ימים ב 30 מעלות צלזיוס (לוח 2, 6,7).
- Re-מושעה תאים rhizobia הם מדולל לריכוז סופי של OD 600 = 0.08 באמצעות פתרון חופשי חנקן תזונה. ההשעיה של 10 מ"ל טרי של ס meliloti היה מוחל על כל צמח מורכב לגרום להיווצרות גולה.
4. זיהוי שורש טראנסגנטי
- שבועיים לאחר rhizobia חיסון, הצמחים הם מורכבים עד מושרשת על ידי שטיפה במים. שורשיה ניתן להפריד בקלות במים מן החולות או perlite.
- אנחנו שמים את השורשים שעיר תחת מיקרוסקופ-UV (ניקון SMZ1500, עירור 460-500nm, 505nm dichroic, הגדר יותר 510nm). שורשי מהונדס GFP הם חיוביים שורשי adventitious GFP הם שליליים. לאחר מכן, אנו אוספים את השורשים accordinז אות ה-GFP, ולספור את המספרים גולה, למדוד את אורך שורש, ולחשב צפיפות שורש לרוחב. שורשי ה-GFP שלילי משמשים שליטה.
5. נציג תוצאות
בניסוי שלנו, את שורשי השיער החדש מחדש מתוך explants ב 2-3 שבועות לאחר A. rhizogenes innoculation. תחת מיקרוסקופ-UV, שורשים מהונדס נושאת את הגן GFP להראות חזק פלואורסצנטי ירוק (איור 1). כמות השורשים מחדש את החלק של ה-GFP השורשים חיובית תלוי בתנאי explants והסביבה צמיחה ממוצע של plants.On מרוכבים, 25% את השורשים הפיק היו שורשים שעירים מהונדס 3. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, 1) אבדון כיסוי פלסטיק, כפי שמוצג על הוידאו, זה מספיק כדי לשמור על לחות במגש הצמיחה בימים הראשונים, וצמחים רק דורשים מעט מים בימים הראשונים. השקיית יתר הוא מזיק היווצרות שורש שעיר; 2) את ריכוז innoculant Agrobacterium חשוב לשינוי. כמות מוגזמת של תאים לא מועילים היווצרות שורש שעיר או היווצרות גולה. ליצירת גולה, הפתרון צריך להיות להשקות חנקן חופשי, אחרת, מעט גושים יהוו.
צמחים שורש שעיר מורכב יכול להיווצר באמצעות cotyledons או שתילים entact כחומר המוצא. רק שינויים קלים של הפרוטוקול הנ"ל ncessary ליצור שורשים שעירים מרקמות אחרות 8. חשוב לציין, כל שורש שעיר הוא אירוע שינוי עצמאית. לכן, פנוטיפים שנצפתה נטמון מרוכבים הם סכום של אירועים transforamtion כמה צריכה להיות מאושרת על ידי חזרות בצמחים מורכב מרובים
באיור 1. א השורשים טראנסגנטי ניתן למיין מתוך שורשים שעירים. גושים ב נוצרו הצמחים שורש שעיר מרוכבים. הנחנו 4 שבועות בת מ צמחים truncatula שורש שעיר תחת מיקרוסקופ-UV ואת השורשים GFP חיובית ניתן לזהות בקלות. (החץ האדום: שורש GFP, חץ צהוב: אי - GFP שורש)
| מניות | g/200ml | מניות מ"ל / ליטר |
| MgSO 4 0.7 H 2 O | 12.3 | 2 |
| CaCl 2 .2 H 2 O | 14.7 | 4 |
| K 2 HPO 4 0.3 H 2 O | 6.8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| פה Cl 3 0.6 H 2 O | 0.49 | 2.5 |
| Micronutrients | ראה להלן | 1 |
| Micronutrients | גרם לליטר |
| H 3 BO 3 | 0.142 |
| MnSO 4. H 2 O | 0.077 |
| ZnSO 4 0.7 H 2 O | .1725 |
| CuSO 4 .5 H 2 O | 0.037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0.024 |
| CoCl 2. H 2 O | .0025 |
| NiSO 4 | 0.001 |
1. טבלת Nitogen ללא תזונה פתרון
| K 2 HPO4 | 0.5g |
| NaCl | 0.1g |
| MgSO 4 ° 7H 2 O | 0.2g |
| תמצית שמרים | 0.4g |
| Mannitol | 10g |
| pH = 6.8 |
טבלה 2. שמרים תמצית בינוני מניטול (לליטר)
Discussion
יצירת plant שורש שעיר מרוכבים היא שיטה קלה ומהירה להשיג כמויות גדולות של חומר מהונדס עבור מינים רבים dicot. אמנם שיטה זו לא יכולה לייצר זרעים מהונדס, הוא יכול לייצר חומרים מהונדס בעוד כמה שבועות. השיטה מתאימה במיוחד עבור הצמחים מתקשים להקים תרביות רקמה או יצירת transformants יציב. במהלך השנים, יש לנו השתמשו בטכנולוגיה זו כדי ללמוד פונקציות גן, פונקציות האמרגן, רנ"א, שורש ופיתוח שורש לרוחב, הגנה ותגובות אביוטי מתח, nodulation תהליכים סימביוטיים אחרים, התגובות הורמון, פרופיל מטבולי, פרופיל גנטי, ניתוח proteomic, ו תהליכים ביולוגיים אחרים. פרוטוקול איתנה לשכפול.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר כריס טיילור (אוהיו סטייט) מציגה טכנולוגיה שורש שעיר למעבדה שלנו, בני הזוג. Senthil סבראמאניאן (דרום דקוטה סטייט), ג'אנג חואן (Ludong אוניברסיטת שנדונג בסין) כדי לשפר את הפרוטוקול. כמו כן, אנו מבקשים להודות לד"ר האו נג (נאנג'ינג החקלאות באוניברסיטה) עבור מסייע ביצירת הווידאו הזאת. עבודה זו נתמך בחלקו על ידי מענקי DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) ו USDA (2010-65116-20514) אל OY
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
