iCLIP - 全转录组，蛋白质与RNA相互作用的映射与个别核苷酸分辨率

Summary

成绩单的RNA结合蛋白的空间安排，是一种转录后调控的关键因素。因此，我们制定个人核苷酸分辨率的紫外光交联和免疫（iCLIP），允许精确的全基因组RNA结合蛋白的结合位点的映射。

Abstract

RNA结合蛋白的独特的成分和空间布局上的谈话全文（限制性商业惯例）的不同方面的指导后转录^调控 1 。因此，对在分子水平上理解转录调控的一个重要步骤是获得关于限制性商业惯例^的 2的结合位点的位置信息。

研究蛋白质- RNA的相互作用可以使用生化方法，但这些方法没有解决的RNA在其本土蜂窝范围内具有约束力。研究蛋白- RNA复合物在细胞环境中的初步尝试，采用差异显示或微阵列分析^（RIP - CHIP）3-5相结合的亲和纯化或免疫。这些方法很容易识别或间接非生理的^相互作用 6 。为了增加特异性和位置的决议，这一战略被称为剪辑（紫外光交联和免疫^）7,8。剪辑结合紫外光交联蛋白质和核糖核酸分子，与严格的净化计划，包括变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。高通量测序技术相结合，作为一个强大的工具来研究蛋白质- RNA的相互作用，在全基因组规模（简称HITS - CLIP或剪辑^{，SEQ）9,10}剪辑已经证明。近日，PAR - CLIP介绍，使用交联^11,12光反应的核苷类似物。

尽管所获得的数据的高特异性，剪辑实验往往产生cDNA文库的有限序列的复杂性。这部分是由于合作纯化的RNA的限制数量和两个低效RNA结扎库准备所需的反应。此外，引物延伸分析表明，许多的cDNA核苷酸交联¹³提前截断。这种截断cDNA的是失去了在标准的剪辑库准备协议。我们最近开发iCLIP（单个核苷酸分辨率的），它可以捕获截断的cDNA取代低效分子RNA结扎的步骤之一，更有效的分子内的基因函证^（图1 ）14。更重要的是，被截断的cDNA测序提供了交叉链接网站的核苷酸决议的立场的见解。我们成功地应用于iCLIP研究核蛋白C的全基因组规模的粒子组织和评估拼接的^第 14作用。

Protocol

1。 UV交联的组织培养细胞

1. 取出介质，并加入6毫升冰冷的PBS细胞生长在一个10厘米的板（足够的三个实验）。
2. 取下盖板，将在冰上。 150兆焦耳/厘米²在254 nm，照射一次。
3. 收获的细胞与细胞起苗刮。
4. 将2毫升细胞悬液，每3微管。最高时速为10秒旋转4 ° C至沉淀细胞，然后去除上清液。
5. 管理单元冻结在-80 ° C，直到使用干冰和存储单元颗粒。

2。珠准备

1. 加入100μL蛋白一个磁珠每到一个新的微管实验（DYNAL 100.02）（使用鼠标或山羊抗体蛋白G磁珠）。
2. 洗珠裂解液（50毫米的Tris - HCl，pH值7.4; 100毫米氯化钠，1％NP - 40，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠，1 / 100的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒第三，Calbiochem）的2倍。
3. 在2-10微克抗体100μL裂解液重悬珠。
4. 在室温为30-60分钟旋转管。
5. 900μL裂解液洗3倍，并准备继续执行步骤4.1离开，直到在最后一次洗涤。

3。细胞裂解和RNA的消化部分

1. 1毫升裂解液转移到1.5 ml的微管，重悬细胞沉淀。
2. 我核糖核酸（Ambion公司，AM2295）准备一个1 / 500稀释。添加10μL核糖核酸我稀释以及2μL涡轮的DNA酶的细胞裂解液（核糖核酸我1 / 500稀释低RNase的1 / 50稀释用于库准备; [高核糖核酸酶抗体的特异性是必要的控制） 。
3. 孵育整整3分钟，在37 ° C在1100 rpm时的晃动，样品。立即传送到冰。
4. 旋转4 ° C和20分钟的22000克，以明确的裂解。仔细收集上清（留约50μL裂解液沉淀）。

4。免疫沉淀

1. 删除从珠（步骤2.5）缓冲液洗，再加入细胞裂解液（步骤3.4）。
2. 旋转2 h后的样品在4 ° C。
3. 弃上清，洗珠900μL高盐缓冲液（50毫米的Tris -盐酸，pH值7.4; 1 M氯化钠; 1毫米EDTA，1％NP - 40，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠）2X。
4. 洗2倍，而与900μL洗涤缓冲液（20毫米的Tris - HCl，pH值7.4; 10毫米MgCl _2的 0.2％Tween - 20的）。

5。去磷酸化的RNA的3'ends

1. 弃上清，重悬在20μLPNK混合珠（15μl水; 4μL5倍PNK pH值6.5缓冲液[350mMTris盐酸，pH值6.5; _50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0.5μLPNK酶0.5μLRNasin [Promega公司]） 。
2. 20分钟在37 ° C。
3. 加入500μl洗涤缓冲液，并用高盐缓冲液1X。
4. 洗涤缓冲液洗2倍。

6。链接器结扎RNA 3'末端

1. 小心取出上清液，重悬在20μL结扎混合珠（9μl水; 4μL4X连接缓冲液[200 mMTris -盐酸;40米MM GCL _2; 40毫米二硫苏糖醇]; 1μLRNA连接酶0.5μL，RNasin [NEB]; Promega公司] 1.5μL预adenylated连接器L3 [20微米; 4μLPEG400 [81170，Sigma公司）。
2. 过夜孵育在16 ° C。
3. 加入500μl洗涤缓冲液，然后用1毫升高盐缓冲的2倍。
4. 洗用1 ml缓冲液洗2倍和1毫升洗第二次离开。

7。 RNA的5'末端标记

1. 取出上清液，重悬在8μL热PNK混合珠（0.4μLPNK [NEB]; ^0.8μL32个P -γ- ATP的0.8μL10X PNK缓冲[NEB]; 6μl水）。
2. 5分钟在37 ° C。
3. 取出热PNK组合和20μL1X Nupage样缓冲液（Invitrogen公司）重悬珠。
4. 在thermomixer孵育70 ° C时为10分钟。
5. 立即将一块磁铁沉淀空珠和负载上清液凝胶（见第8步）。

8。 SDS - PAGE和膜内转印

1. 负载的样品在4-12％NuPAGE双三凝胶（Invitrogen公司）根据制造商的指示。使用1X MOPS运行缓冲液（Invitrogen）的0.5升。还可以加载5μL预染蛋白大小的标记（例如页统治者加，Fermentas公司，SM1811）。
2. 运行50分钟的凝胶在180 V。
3. 取出凝胶前和丢弃的固体废物（含免费放射性ATP的）。
4. 蛋白- RNA复合物，从凝胶转移到硝酸纤维素膜，使用NOVEX调湿装置，根据制造商的说明（Invitrogen公司，转让1小时在30 V）。
5. 转让后，PBS缓冲液冲洗膜，然后在保鲜膜包装，并到富士胶片暴露于-80 ° C（地方一个荧光贴纸膜后ALIGN T他的膜和膜30分钟，1小时，在夜间执行曝光）。

9。 RNA分离

1. 从低核糖核酸作为面膜的步骤8.5中使用的放射自显影的实验分离蛋白- RNA复合物。这片膜切成若干小片，放入1.5 ml的微管。
2. 添加200μLPK缓冲区（100毫米的Tris - HCl pH 7.4的50 mM氯化钠10毫米EDTA）和10μL蛋白酶K（罗氏，03115828001）膜件。孵育20分钟1100转的摇晃，在37 ° C。
3. PKurea缓冲区（100毫米的Tris - HCl pH 7.4的50 mM氯化钠10毫米EDTA; 7 M尿素）加入200μL和20分钟在37 ° C。
4. 收集解决方案，并添加400μLRNA的酚/氯仿（Ambion公司，9722）2毫升锁相凝胶重型管（713-2536，VWR）。
5. 孵育5分钟在30 ° C，在1100 rpm时的晃动。 13000 RPM在室温5分钟旋转分离的阶段。
6. 转移到一个新的管水层（要小心，不要触摸移液器凝胶）。添加0.5μLglycoblue（Ambion公司，9510）和40μL3 M醋酸钠pH值5.5和混合。然后加入1 ml 100％的乙醇，再次组合，在夜间沉淀于-20 ° C

10。反转录

1. 20分钟转速15,000 RPM和4 ° C。去除上清液，并用0.5毫升80％乙醇沉淀。
2. 7.25μLRNA /引物组合（6.25μl水0.5μLRclip底漆[0.5pmol/μl]; 0.5μLdNTP混合液[10毫米），重悬沉淀。对于每个实验或复制，使用不同Rclip的引物，包含个人的条码序列（见14）。
3. 孵育5分钟，在70℃前冷却至25 ° C。
4. 添加2.75μLRT组合（2μL的5倍RT缓冲; 0.5μL0.1M数码地面电视服务; 0.25μL标III逆转录Invitrogen公司]）。
5. 孵育5分钟在25℃，20分钟，42℃，40分钟，在50 ° C和5分钟，在80℃前冷却至4 ° C。
6. 加入90μLTE缓冲液，0.5μLglycoblue，10μL醋酸钠pH值5.5和混合。然后加入250μL100％的乙醇，混合和过夜沉淀于-20 ° C

11。凝胶纯化的cDNA

1. 降速和洗的样本（见10.1），然后重新悬浮颗粒在水6μL。
2. 加入6μL的2倍TBE -尿素样缓冲液（Invitrogen公司）。加热样品至80 ° C为直接装载前3分钟。
3. 装入预制6％TBE -尿素凝胶（Invitrogen）的样品和制造商的180 V 40分钟运行。此外，负载低分子量标记，为后续的切削（见下文）。
4. 削减120-200新台币（高），85-120 NT（中）和70-85 NT（低）三个波段。使用theupper染料，塑料凝胶支持的标志，引导切除术（见图3）。请注意，Rclip底漆和三层序列合计占52 NT的剪辑顺序。
5. 加入400μLTE和粉碎成小块，用1毫升注射器的柱塞的凝胶片。孵育2小时在1100 RPM晃动在37 ° C。
6. 将两个1厘米的玻璃预过滤器进入一个中光学SpinX列（康宁公司，8161）（滤纸，1823010）。液体样品的部分转移到列。自旋为1分钟到1.5 ml管13000 RPM。
7. 添加0.5μLglycoblue和40μL醋酸钠的pH值5.5，然后混合样本。添加1毫升100％的乙醇，重新组合和过夜沉淀在-20 ° C。

12。 cDNA的5'端引物的结扎

1. 降速和洗的样本（见10.1），然后重新悬浮颗粒在8μL结扎组合（6.5μl水，0.8μL10倍CircLigase缓冲区第二; 0.4μL50毫米MnCl _2; 0.3μL; Circligase II [震中]），并培育在60 ° C 1小时
2. 加入30μl的寡核苷酸退火组合（26μl水; 3μLFastDigest缓冲[Fermentas公司; 1μLcut_oligo [10μM]）。孵育1分钟，在95 ° C。然后下降的温度每20秒1 ° C到25 ° C是达到了。
3. 2μLBamHI位（快速Fermentas公司）在37和30分钟的孵化° C。
4. 加入50μLTE和0.5μLglycoblue和混合。添加10μL醋酸钠pH值5.5和混合，再加入250μL100％的乙醇。再次在夜间混合和沉淀于-20 ° C

13。 PCR扩增

1. 降速和洗的样本（见10.1），然后在19μl水重悬沉淀。
2. 准备PCR混合物（19μL的cDNA; 1μL引物组合P5/P3公司Solexa，每10μM; 20μLAccuprime Supermix 1酶[Invitrogen公司]）。
3. 运行下面的PCR程序：94℃15秒，65℃30秒，30秒，68 ° _{C] 25-35}个循环，68 ° C为3分，4个94 ° C，2分钟， ° C直到永远。
4. 混合8μLPCR产物与2μL预制6％TBE凝胶上装载的5倍TBE缓冲和负载（Invitrogen）。 Sybrgreen我（Invitrogen）的凝胶染色，用凝胶成像仪分析。
5. 在Rclip引物的条形码允许复用不同的样品的高通量测序之前提交。提交15μL测序库和存储休息。

14。链接程序和引物序列

前adenylated 3'连接器的DNA：

我们为了从IDT的DNA适配器，然后分装的20μM。]

15。代表性的成果：

测序iCLIP库之前，实验的成功，可以监视两个步骤：膜内转印后的蛋白质- RNA复合物（步骤8.5）和PCR产物的凝胶图像（13.4步）放射自显影。在低核糖核酸样本的放射自显影，弥漫性放射性应被视为上述分子量的蛋白质（图2，样品4）。对于高核糖核酸样本，这种放射性是接近的蛋白质的分子量（图2，样品3）集中。如果没有抗体是免疫，应检测无信号（图2，样品1和2）。特异性免疫的进一步重要的控制，要么省略紫外线照射，或使用不表达的细胞蛋白质^的利息14。

的PCR产物（13.4步）的凝胶图像显示大小的范围内，对应纯化步骤11.4（图4，泳道4-6）cDNA的部分（高，中，低）。请注意，PCR引物P3Solexa和P5Solexa，引入一个额外的76 NT的cDNA的大小。如果没有抗体的免疫过程中使用，没有相应的PCR产物（图4，泳道1-3）应检测。引物二聚体的产品可以出现在约140 NT。

对于代表的高通量的测序和随后生物信息学分析结果^，看到14。

图1。iCLIP协议的示意图。蛋白质- RNA复合物共价交联用紫外线照射（步骤1）体内。感兴趣的蛋白质纯化与结合的RNA（步骤2-5）。为了让序列特异性逆转录吸，一种RNA适配器是RNA的3'端结扎，而放射性标记的5'端（步骤6和7）。交联蛋白- RNA复合物是免费的RNA纯化，用SDS - PAGE和膜内转印（步骤8）。 RNA是从膜回收，通过消化的蛋白质与蛋白酶K留在交叉链接核苷酸（步骤9）多肽其余。反转录（RT）在余下的多肽截断，并介绍了两种裂解适配器地区和条形码序列（10步）。大小选择删除前函证免费RT引物。下面的线性生成合适的模板进行PCR扩增（步骤11-15）。最后，高通量测序生成读取条形码序列会立即被最后的cDNA核苷酸（16步）。由于这核苷酸位于一个位置的交联核苷酸上游，结合部位，可以推导出高分辨率。

图2交联的核蛋白的C - RNA复合物的放射自显影使用变性凝胶电泳和膜转移。 （α核蛋白核蛋白的C - RNA复合物从细胞提取核蛋白彗星对使用一种抗体免疫纯化，样品3和4）。 RNA部分被消化，使用低（+）或高（+）浓度的RNase。可以观察到向上移位大小的蛋白质（40 kDa）的配合物（样品4）。这种转变是不太明显，当高浓度的RNase（样品3）。放射性信号消失时没有抗体用于免疫沉淀（样品1和2）。

图3。示意图6％TBE -尿素凝胶（Invitrogen公司），以指导切除iCLIP cDNA产物。凝胶是运行在180 V，导致重复的迁移模式的cDNA和染料在凝胶（光与暗蓝色）为40分钟。使用刀片切割（红线）高（H），中（M），低（L）cDNA的分数。开始在中间的淡蓝色染料，并立即上述商标切割塑料胶盒。划分中，低分数和修剪约1厘米以上的淡蓝色染料的高分数。使用的口袋和染料的指导下的垂直切割，分开不同的车道（在这个例子1-4）。标记巷（M）可以染色，成像控制后切割的尺寸。片段大小显示在右侧。

图4。iCLIP使用凝胶电泳PCR扩增cDNA文库的分析。 RNA收回膜（图1）反转录和大小纯化变性凝胶电泳（图2）。三个大小比例的cDNA（高[H +]：[M]：85-120 NT和低[左]：70-85 NT），中型120-200 NT被收回，发送，重新线性和PCR扩增。输入分数的大小不同的结果可以观察到不同的粒度分布的PCR产物。由于PCR引物的cDNA引入76 NT，尺寸范围应161-196新台币为高，中等和146-161粒级低的NT 196-276台币之间。 PCR产物均缺席时没有抗体是免疫（1-3车道）。

Discussion

，由于iCLIP协议中含有各种各样的酶反应和纯化步骤，它并不总是很容易识别一个实验失败时的问题。为了控制一个或多个阴性对照确定RNA交叉链接网站的特殊性，应保持完整的实验和其后的计算分析。这些控件可无抗体的样品，非交联的细胞，或从基因敲除的细胞或组织免疫。理想的情况下，这些控制实验不应净化任何蛋白- RNA复合物，并因此应该没有信号，SDS - PAGE凝胶和PCR扩增后没有检测到产品。这些控制库的高通量测序应该返回很少有独特的序列。击倒细胞不建议作为时序控制，因为由此产生的序列仍然符合相同的蛋白质，这是小批量击倒细胞纯化的交叉链接网站。

注意事项也应考虑，以避免与以前的实验PCR产物的污染。最大限度地减少这种问题的最好办法是在空间上分开前和后的PCR步骤。理想的情况下，PCR产物和所有后续步骤的分析，应在一个单独的房间内进行。此外，实验室中的每个成员应该使用他们自己的缓冲区和其他试剂。这样可以更容易识别，污染源。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands