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Biology

iCLIP - व्यक्तिगत nucleotide संकल्प के साथ transcriptome प्रोटीन शाही सेना सहभागिता के व्यापक मानचित्रण

Published: April 30, 2011 doi: 10.3791/2638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 3, 4, 2, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

एक प्रतिलेख पर शाही सेना - बंधनकारी प्रोटीन के स्थानिक व्यवस्था के बाद transcriptional विनियमन के एक प्रमुख निर्धारक है. इसलिए, हम व्यक्ति nucleotide संकल्प यूवी crosslinking और immunoprecipitation (iCLIP) है कि एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के सटीक जीनोम चौड़ा मैपिंग की अनुमति देता है विकसित की है.

Protocol

1. यूवी पार जोड़ने टिशू कल्चर की कोशिकाओं

  1. मीडिया निकालें और 6 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस (तीन प्रयोगों के लिए पर्याप्त) एक 10 सेमी की थाली में विकसित कोशिकाओं को जोड़ने.
  2. बर्फ पर ढक्कन और स्थान निकालें. MJ 150 254 एनएम / 2 सेमी के साथ एक बार चमकाना.
  3. एक सेल चोर के साथ scraping द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट.
  4. 2 मिलीलीटर सेल निलंबन तीन microtubes के प्रत्येक के लिए स्थानांतरण. 4 में 10 सेकंड के लिए शीर्ष गति से स्पिन डिग्री सेल्सियस गोली कोशिकाओं को फिर सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  5. स्नैप - फ्रीज -80 पर सूखी बर्फ और दुकान पर सेल छर्रों डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.

2. मनका तैयारी

  1. प्रोटीन की 100 μl एक Dynabeads (Dynal, 100.02) के एक ताजा microtube करने के लिए प्रति प्रयोग (एक माउस या बकरी एंटीबॉडी के लिए प्रोटीन जी Dynabeads का उपयोग करें). जोड़ें
  2. Lysis बफर (, 100 मिमी NaCl, 1 एनपी 40%, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1 / 100 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल III, Calbiochem 50 Tris - एचसीएल, पीएच 7.4 मिमी) के साथ 2x मोती धो
  3. 20-10 μg एंटीबॉडी के साथ 100 μl lysis बफर में मोती Resuspend.
  4. कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए ट्यूबों का घुमाएँ.
  5. 900 μl lysis बफर के साथ 3x धो और पिछले धोने में जब तक 4.1 कदम आगे बढ़ने के लिए तैयार छोड़.

3. सेल lysis और आंशिक आरएनए पाचन

  1. 1 मिलीलीटर lysis बफर और 1.5 मिलीलीटर microtubes करने के लिए स्थानांतरण में सेल गोली Resuspend.
  2. RNase मैं (Ambion, AM2295) के एक कमजोर पड़ने 1 / 500 तैयार करें. 10 μl RNase मैं के रूप में अच्छी तरह के रूप में कमजोर पड़ने 2 μl सेल lysate टर्बो DNase जोड़ें (1 / 500 RNase मैं dilutions [कम RNase] पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाता है, 1 / 50 dilutions [उच्च RNase] एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं) .
  3. वास्तव में 37 में 3 मिनट ° सी, +११०० rpm पर मिलाते के लिए नमूनों को सेते हैं. तुरंत बर्फ हस्तांतरण.
  4. 4 में स्पिन डिग्री सेल्सियस और 20 मिनट के लिए 22,000 ग्राम lysate स्पष्ट. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा (के बारे में 50 गोली के साथ μl lysate छोड़).

4. Immunoprecipitation

  1. मोती (2.5 कदम से) से धो बफर निकालें, और तब कक्ष lysate (3.4 कदम से) जोड़ें.
  2. 4 में 2 घंटे के लिए नमूने घुमाएँ डिग्री सेल्सियस
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 900 μl उच्च नमक बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल, 7.4 पीएच, 1 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% एनपी 40, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate) के साथ 2x मोती धोने.
  4. 900 μl धोने बफर (10 मिमी 2 MgCl; 0.2% बीच - 20 20 Tris - एचसीएल मिमी, पीएच 7.4) के साथ 2x धो

5. शाही सेना 3'ends के Dephosphorylation

  1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 20 μl PNK मिश्रण में मोती resuspend (15 μl पानी, 4 μl 5x PNK पीएच 6.5 बफर [350mMTris - एचसीएल, 6.5 पीएच, 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2], 0.5 μl PNK एंजाइम, 0.5 μl RNasin [Promega]).
  2. 37 पर 20 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. 500 μl धोने बफर जोड़ें और उच्च नमक बफर के साथ 1x धोने.
  4. धोने बफर के साथ 2x धो.

6. Linker 3 'समाप्त होता है आरएनए ligation

  1. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 20 μl ligation के मिश्रण में मोती resuspend (9 μl पानी, 4 μl 4x ligation बफर [40m एम.एम. GCL 2, 40 मिमी dithiothreitol mMTris एचसीएल 200], 1 μl आरएनए ligase [ठोंग]; 0.5 μl RNasin [] Promega, 1.5 μl पूर्व adenylated linker L3 [20 सुक्ष्ममापी], 4 PEG400 μl [81170, सिग्मा]).
  2. 16 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
  3. 500 μl धोने बफर जोड़ें और तब 1 मिलीलीटर उच्च नमक बफर के साथ 2x धोने.
  4. 1 मिलीलीटर धोने बफर के साथ 2x और दूसरा धोने के 1 मिलीलीटर में छोड़ धो लें.

7. शाही सेना के 5 'के अंत लेबलिंग

  1. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म PNK मिश्रण की 8 μl में मोती resuspend (0.4 μl PNK [ठोंग]; 0.8 μl 32 पी γ-एटीपी, 0.8 μl 10x PNK बफर [ठोंग], 6 μl पानी).
  2. 37 पर 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. गर्म PNK मिश्रण निकालें और 20 μl 1x Nupage लोड हो रहा है बफर (Invitrogen) में मोती resuspend.
  4. 70 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए पर एक thermomixer पर सेते हैं.
  5. तुरंत एक चुंबक पर जगह खाली मोती वेग और जेल पर सतह पर तैरनेवाला लोड (कदम 8 देखें).

8. एसडीएस पृष्ठ और झिल्ली हस्तांतरण

  1. एक 4-12% NuPAGE बीआईएस Tris निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल (Invitrogen) पर नमूने लोड. 1x MOPS बफर (Invitrogen) चलाने के 0.5 एल का प्रयोग करें. इसके अलावा पूर्व से सना हुआ एक प्रोटीन आकार मार्कर (उदाहरण के लिए पन्ना शासक प्लस, Fermentas, SM1811) के 5 μl लोड.
  2. जेल में 50 मिनट के लिए 180 भागो वी.
  3. जेल सामने निकालें और ठोस अपशिष्ट के रूप में त्यागने (मुक्त रेडियोधर्मी एटीपी शामिल).
  4. जेल से एक nitrocellulose निर्माता के निर्देशों (Invitrogen, हस्तांतरण एक 30 वी में ज) के अनुसार Novex गीला हस्तांतरण तंत्र का उपयोग झिल्ली प्रोटीन शाही सेना परिसरों स्थानांतरण.
  5. हस्तांतरण के बाद, PBS बफर में झिल्ली कुल्ला, तो यह सरन लपेट में लपेट और यह एक फ़ूजी फिल्म के लिए -80 डिग्री सेल्सियस (झिल्ली को एक फ्लोरोसेंट बगल में स्टीकर बाद टी संरेखित जगह पर बेनकाबफिल्म और वह झिल्ली, 30 मिनट, 1 और रात से अधिक के लिए जोखिम प्रदर्शन).

9. शाही सेना अलगाव

  1. एक मुखौटा के रूप में 8.5 कदम से कम RNase autoradiograph का उपयोग कर प्रयोग से प्रोटीन शाही सेना परिसरों पृथक. कई छोटे स्लाइस में झिल्ली के इस टुकड़े काटें और एक 1.5 मिलीलीटर microtube में उन्हें जगह.
  2. झिल्ली टुकड़े करने के लिए और 10 μl proteinase कश्मीर (Roche, 03115828001) 200 μl पीके (10 मिमी EDTA, 50 मिमी NaCl 100 मिमी Tris - एचसीएल 7.4 पीएच) बफर जोड़ें. 37 पर 20 मिनट के लिए 1100 rpm पर मिलाते सेते डिग्री सेल्सियस
  3. PKurea बफर (NaCl, 50 मिमी, 10 मिमी EDTA, 100 मिमी Tris - एचसीएल 7.4 पीएच 7 एम यूरिया) के 200 μl जोड़ें और 37 पर 20 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  4. समाधान लीजिए और यह / एक 2 मिलीलीटर चरण बंद जेल भारी ट्यूब (713-2536, VWR) करने के लिए phenol क्लोरोफॉर्म (Ambion, 9722) शाही सेना के 400 μl के साथ एक साथ जोड़ने के.
  5. 30 से कम 5 मिनट ° C के लिए सेते हैं, 1100 rpm पर मिलाते. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 13,000 rpm पर कताई द्वारा अलग चरणों.
  6. एक नया ट्यूब में जलीय परत स्थानांतरण (विंदुक के साथ जेल छू नहीं सावधान रहना). Μl 0.5 (Ambion, 9510) glycoblue और 40 μl एम 3 सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें. फिर एक मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ने, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

10. रिवर्स प्रतिलेखन

  1. 15,000 rpm और 4 में 20 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस निकालें सतह पर तैरनेवाला और 0.5 मिलीलीटर 80% इथेनॉल के साथ गोली धोने.
  2. 7.25 μl आरएनए / प्राइमर मिश्रण (; 0.5 μl Rclip प्राइमर [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP मिश्रण [10mm] 6.25 μl पानी) में गोली Resuspend प्रत्येक प्रयोग या नकल के लिए, एक अलग Rclip व्यक्तिगत बारकोड अनुक्रम (14 देखें) से युक्त प्राइमर का उपयोग करें.
  3. 70 में 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने से पहले
  4. 2.75 μl आरटी (0.5 μl 0.1M डीटीटी; 0.25 μl सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस [Invitrogen] 2 μl 5x आरटी बफर) मिश्रण जोड़ें.
  5. 25 में 5 मिनट सेते डिग्री सेल्सियस, 42 में 20 मिनट डिग्री सेल्सियस, 50 में 40 मिनट डिग्री सेल्सियस और 80 पर 5 मिनट पहले 4 से ठंडा डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस
  6. 90 μl बफर ते, 0.5 μl glycoblue और 10 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें. फिर 250 μl 100% इथेनॉल जोड़ने, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

11. सीडीएनए की जेल शुद्धि

  1. नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें) है, तो पानी के 6 μl में छर्रों resuspend.
  2. 6 μl 2x लोड हो रहा है TBE यूरिया बफर (Invitrogen) जोड़ें. हीट नमूने 80 डिग्री सेल्सियस सीधे लोड करने से पहले 3 मिनट के लिए.
  3. एक मिल में बना हुआ 6% जेल TBE यूरिया (Invitrogen) पर नमूने लोड और 180 के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित वी पर 40 मिनट के लिए चला. इसके अलावा बाद काटने (नीचे देखें) के लिए एक कम आणविक भार मार्कर लोड.
  4. 120-200 (उच्च) NT, 85-120 (मध्यम) NT और 70-85 NT के (कम) में तीन बैंड कट. Theupper डाई और प्लास्टिक जेल समर्थन पर निशान का उपयोग करने के लिए (चित्रा 3 देखें) छांटना गाइड. ध्यान दें कि Rclip और क्लिप के अनुक्रम के 52 NT के लिए L3 साथ अनुक्रम खाते प्राइमर.
  5. 400 μl ते जोड़ें और छोटे टुकड़ों में 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार का उपयोग जेल टुकड़ा कुचलने. 37 पर 2 घंटे के लिए 1,100 rpm पर मिलाते सेते डिग्री सेल्सियस
  6. जगह दो 1 सेमी गिलास costar SPINX स्तंभ (Corning शामिल, 8161) में पूर्व फिल्टर (वाटमान, 1,823,010). स्तंभ नमूने के तरल भाग स्थानांतरण. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 13,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन.
  7. 0.5 μl glycoblue और 40 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच जोड़ें, तो नमूना मिश्रण. 1 मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ें, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

12. प्राइमर के सीडीएनए के 5'end के लिए Ligation

  1. और सेते नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें), तो 8 μl ligation (, 0.8 μl 10x CircLigase बफर द्वितीय, 0.4 μl 50 मिमी 2 MnCl; μl 0.3 Circligase द्वितीय [Epicentre] 6.5 μl पानी) मिश्रण में छर्रों resuspend 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए
  2. 30 μl oligo annealing के मिश्रण जोड़ें (26 μl पानी, 3 μl FastDigest बफर [Fermentas], 1 μl cut_oligo [10 सुक्ष्ममापी]). 95 पर 1 मिनट के लिए सेते ° सी. फिर तापमान हर 20 सेकंड में कमी 1 से डिग्री सेल्सियस 25 जब तक डिग्री सेल्सियस तक पहुँच कर रहे हैं.
  3. 2 μl (फास्ट Fermentas) BamHI और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जोड़ें
  4. 50 μl ते और 0.5 μl glycoblue और मिश्रण जोड़ें. 10 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें, तो 250 μl 100% इथेनॉल जोड़ें. रात फिर से और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर मिक्स

13. पीसीआर प्रवर्धन

  1. नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें) है, तो 19 μl पानी में गोली resuspend.
  2. पीसीआर मिश्रण तैयार करें (19 μl सीडीएनए, 1 μl प्राइमर मिश्रण P5/P3 solexa, 10 सुक्ष्ममापी, 20 μl Accuprime Supermix एक एंजाइम [Invitrogen]).
  3. निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएँ: 25-35 चक्र, 68 ° सी 3 मिनट के लिए, 4 [30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड के लिए, 68 डिग्री सेल्सियस] 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए, डिग्री सेल्सियस हमेशा के लिए.
  4. एक मिल में बना हुआ 6% TBE जेल पर 2 5x TBE लोड हो रहा है बफर और लोड के μl (invit के साथ 8 μl पीसीआर उत्पाद मिक्सrogen). Sybrgreen मैं (Invitrogen) के साथ जेल दाग और एक जेल imager के साथ विश्लेषण.
  5. Rclip प्राइमरों में बारकोड मल्टीप्लेक्स उच्च throughput अनुक्रमण के लिए भेजने से पहले विभिन्न नमूनों के लिए अनुमति देते हैं. अनुक्रमण के लिए लायब्रेरी का 15 μl सबमिट करें और आराम की दुकान.

14. Linker और प्राइमर दृश्यों

पूर्व adenylated 3 'linker डीएनए:

[हम IDT से डीएनए एडाप्टर के आदेश और फिर 20μM की aliquots.]

डीएनए

15. प्रतिनिधि परिणाम:

ICLIP पुस्तकालय का अनुक्रमण करने के लिए, पहले प्रयोग की सफलता दो कदम पर नजर रखी जा सकता है: झिल्ली स्थानांतरण के बाद जटिल प्रोटीन शाही सेना (8.5 कदम) और पीसीआर उत्पादों की जेल छवि (13.4 कदम) के autoradiograph. कम RNase नमूने के autoradiograph में फैलाना रेडियोधर्मिता प्रोटीन (चित्रा 2, 4 नमूना) के आणविक वजन से ऊपर देखा जाना चाहिए. उच्च RNase नमूने लिए, इस रेडियोधर्मिता प्रोटीन की आणविक भार (चित्र 2, 3 नमूना) के लिए करीब ध्यान केंद्रित है. जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation में प्रयोग किया जाता है, कोई संकेत (चित्रा 2, 1 नमूनों और 2) पता होना चाहिए. Immunoprecipitation की विशिष्टता के लिए इसके अलावा महत्वपूर्ण नियंत्रण या तो यूवी विकिरण का उपयोग करें या कोशिकाओं है कि 14 ब्याज की प्रोटीन व्यक्त नहीं चूकना.

पीसीआर उत्पादों (13.4 कदम) की जेल छवि एक आकार सीमा है कि 11.4 कदम (चित्र 4, गलियों 06/04) में शुद्ध सीडीएनए अंश (उच्च, मध्यम, या कम) से मेल खाती है दिखाना चाहिए. ध्यान दें कि पीसीआर प्राइमरों P3Solexa और P5Solexa सीडीएनए के आकार के लिए एक अतिरिक्त 76 NT के परिचय. यदि कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation के दौरान प्रयोग किया जाता है, कोई इसी पीसीआर उत्पादों की (चित्रा 4, 1-3 गलियों) पता होना चाहिए. प्राइमर डिमर उत्पाद के बारे में 140 NT के पर प्रदर्शित कर सकते हैं.

उच्च throughput अनुक्रमण और बाद में bioinformatic विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों के लिए 14 देखें.

चित्रा 1
चित्रा 1 iCLIP प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रोटीन शाही सेना परिसरों covalently यूवी विकिरण (चरण 1) का उपयोग vivo में पार से जुड़े. ब्याज की प्रोटीन एक साथ बाध्य शाही सेना (2-5 कदम) के साथ शुद्ध है. रिवर्स प्रतिलेखन के विशिष्ट अनुक्रम भड़काना के लिए अनुमति देते हैं, एक शाही सेना अनुकूलक 3 ligated है शाही सेना के अंत है, जबकि 5 'अंत radioactively (कदम 6 और 7) लेबल है. क्रॉस से जुड़े प्रोटीन शाही सेना परिसरों मुक्त एसडीएस पृष्ठ झिल्ली और हस्तांतरण (कदम 8) का उपयोग शाही सेना से शुद्ध कर रहे हैं. शाही सेना proteinase कश्मीर nucleotide पार से लिंक (कदम 9) में एक शेष पॉलीपेप्टाइड छोड़ने के साथ प्रोटीन को पचाने के द्वारा झिल्ली से बरामद किया है. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) शेष पॉलीपेप्टाइड truncates और दो cleavable एडाप्टर क्षेत्रों और बारकोड अनुक्रम (10 कदम) का परिचय है. साइज चयन circularization से पहले मुक्त आरटी प्राइमर निकालता है. निम्नलिखित linearization पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयुक्त टेम्पलेट्स (11-15 कदम) उत्पन्न करता है. अंत में, उच्च throughput अनुक्रमण पढ़ता है जिसमें बारकोड दृश्यों तुरंत सीडीएनए के अंतिम nucleotide (16 कदम) द्वारा पीछा कर रहे हैं उत्पन्न. इस nucleotide रेखांकित एक पार से जुड़े nucleotide के अपस्ट्रीम स्थिति के बाद से, बाध्यकारी साइट उच्च संकल्प के साथ deduced किया जा सकता है है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Autoradiograph के पार से जुड़े hnRNP सी आरएनए परिसरों denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन और झिल्ली हस्तांतरण का उपयोग कर. hnRNP सी आरएनए परिसरों सेल hnRNP सी के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करने के अर्क से इम्युनो - शुद्ध (α hnRNP सी, 3 नमूने और 4). शाही सेना आंशिक रूप से कम (+) या उच्च का उपयोग कर पचा गया था (+) RNase की एकाग्रता. प्रोटीन के आकार (40 केडीए) से ऊपर की ओर स्थानांतरण परिसर (4 नमूना) मनाया जा सकता है. पाली कम स्पष्ट है जब RNase के उच्च सांद्रता (3 नमूना) इस्तेमाल किया गया. रेडियोधर्मी संकेत गायब हो जाता है जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation में इस्तेमाल किया गया था (1 नमूनों और 2) है.

चित्रा 3
चित्रा 3. योजनाबद्ध 6% जेल TBE - यूरिया (Invitrogen) iCLIP सीडीएनए उत्पादों के छांटना मार्गदर्शन करने के लिए. जेल के 180 और जेल में cDNAs रंजक (प्रकाश और गहरे नीले रंग) की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवास पैटर्न के लिए प्रमुख वी पर 40 मिनट के लिए चलाया जाता है. एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें (लाल रेखा) उच्च (एच), (एम), मध्यम और कम (एल) सीडीएनए भिन्न कटौती. प्लास्टिक जेल कैसेट पर हल्के नीले रंग की डाई के बीच में और तुरंत निशान से ऊपर काटने के द्वारा शुरू करो. मध्यम और कम भिन्न फूट डालो और हल्के नीले रंग की डाई ऊपर 1 सेमी के बारे में उच्च अंश ट्रिम. ऊर्ध्वाधर जेब और डाई द्वारा निर्देशित करने के लिए अलग अलग गलियों (इस उदाहरण में 1-4) में कटौती का उपयोग करें. मार्कर लेन (मीटर) और दाग नियंत्रण imaged किया जा सकता हैकाटने के बाद आकार. टुकड़ा आकार दाईं तरफ संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4 पीसीआर प्रवर्धित iCLIP सीडीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग पुस्तकालयों का विश्लेषण . शाही सेना रिवर्स लिखित और आकार शुद्ध denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2) का उपयोग झिल्ली (चित्रा 1) से बरामद किया. तीन का आकार भिन्न सीडीएनए (उच्च [एच]: 120-200 NT के, मध्यम [एम]: 85-120 NT और कम [L]: NT के 70-85) बरामद किए गए, circularized, फिर linearized और पीसीआर प्रवर्धित. विभिन्न आकार के वितरण के पीसीआर उत्पादों इनपुट भिन्न के विभिन्न आकारों का एक परिणाम के के रूप में मनाया जा सकता है. चूंकि पीसीआर प्राइमर सीडीएनए 76 NT के परिचय, आकार 196-276 NT के बीच उच्च, 161-196 NT के लिए मध्यम और कम आकार भिन्न के लिए 146-161 NT के के लिए सीमा चाहिए. पीसीआर उत्पादों अनुपस्थित रहे हैं जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation (03/01 गलियों) के लिए इस्तेमाल किया गया था.

Discussion

चूंकि iCLIP प्रोटोकॉल एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और शुद्धि चरणों की एक विविध रेंज शामिल हैं, यह हमेशा आसान नहीं है एक समस्या है जब एक प्रयोग विफल रहता है की पहचान. आदेश में शाही सेना पार से लिंक साइटों की पहचान की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए, एक या अधिक नकारात्मक नियंत्रण पूरा प्रयोग और बाद में कम्प्यूटेशनल विश्लेषण भर में बनाए रखा जाना चाहिए. इन नियंत्रणों नमूना नहीं एंटीबॉडी, गैर पार से जुड़े कोशिकाओं, या पीटकर कोशिकाओं या ऊतकों से immunoprecipitation जा सकता है. आदर्श रूप में, इन नियंत्रण प्रयोगों किसी भी प्रोटीन शाही सेना परिसरों नहीं शुद्ध, और इसलिए जेल एसडीएस पृष्ठ पर कोई संकेत है, और पीसीआर प्रवर्धन के बाद कोई detectable उत्पादों देना चाहिए चाहिए. इन नियंत्रण पुस्तकालयों के उच्च throughput अनुक्रमण बहुत कुछ अद्वितीय दृश्यों लौट जाना चाहिए. नॉकडाउन कोशिकाओं एक अनुक्रमण नियंत्रण के रूप में की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, क्योंकि परिणामस्वरूप दृश्यों अभी भी एक ही प्रोटीन है, जो छोटी मात्रा में पछाड़ना कोशिकाओं से शुद्ध होता है के पार से लिंक साइटों के लिए अनुरूप.

सावधानियां भी पिछले प्रयोगों से पीसीआर उत्पादों के साथ संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इस समस्या को कम करने के लिए सबसे अच्छा तरीका spatially पूर्व और बाद पीसीआर के चरणों अलग है. आदर्श रूप में, पीसीआर उत्पादों और बाद के सभी चरणों के विश्लेषण एक अलग कमरे में किया जाना चाहिए. इसके अलावा, प्रयोगशाला के प्रत्येक सदस्य buffers और अन्य अभिकर्मकों के अपने स्वयं के सेट का उपयोग करना चाहिए. इस तरह, संदूषण के स्रोतों की पहचान आसान हो सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों चर्चा और प्रयोगात्मक सहायता के लिए Ule Luscombe, और Zupan प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद. हम उच्च throughput अनुक्रमण के लिए जेम्स Hadfield और Nik मैथ्यू धन्यवाद. हम बाहर बिंदु है कि iCLIP विधि यहाँ वर्णित शेयर मूल क्लिप प्रोटोकॉल के साथ कई कदम, रॉबर्ट Darnell की प्रयोगशाला में कर्क जेन्सेन और JU द्वारा विकसित करना चाहते हैं. इस काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद JU और एक लंबी अवधि के मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम जेके करने के लिए फैलोशिप के लिए 206,726 - क्लिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

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References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

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सेलुलर जीवविज्ञान 50 अंक शाही सेना जैव रसायन transcriptome जीव विज्ञान प्रणाली आरएनए बंधनकारी प्रोटीन

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

iCLIP - व्यक्तिगत nucleotide संकल्प के साथ transcriptome प्रोटीन शाही सेना सहभागिता के व्यापक मानचित्रण
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Konig, J., Zarnack, K., Rot, G.,… More

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

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