iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Summary

Transkript RNA bağlayıcı proteinlerin mekansal düzenleme, post-transkripsiyonel regülasyonunda önemli bir belirleyicisidir. Bu nedenle, bir RNA bağlayıcı protein bağlama bölgeleri hassas genom haritalama sağlar bireysel nükleotid çözünürlük UV crosslinking ve immunoprecipitation (iCLIP) geliştirdi.

Abstract

Bir transkript RNA bağlayıcı proteinlerin benzersiz kompozisyon ve mekansal düzenleme (RBPs) post-transkripsiyonel yönetmelik ¹ farklı yönlerini rehberlik eder. Bu nedenle, moleküler düzeyde transkript yönetmelik anlaşılması yönünde önemli bir adım ^RBPs 2 bağlanma yerleri konumsal bilgi elde etmektir .

Protein-RNA etkileşimleri biyokimyasal yöntemler kullanılarak çalışıldı, ancak bu yaklaşımların kendi doğal hücresel bağlamında bağlayıcı RNA adresi yok. İlk girişimleri kendi hücresel ortamı RNA protein kompleksleri çalışma diferansiyel görüntülemek veya mikroarray analizi (RIP-CHIP) ^3-5 ile kombine yakınlık arıtma veya immunoprecipitation çalışmaktadır. Bu yaklaşımlar, dolaylı ya da fizyolojik olmayan ^{etkileşimleri} 6 belirlenmesi eğilimli . CLIP (UV çapraz bağlama ve immunoprecipitation) ^7,8 tanıtıldı özgüllük ve konumsal çözünürlüğü artırmak için, bir strateji anılacaktır. CLIP UV çapraz bağlama denatüre poliakrilamid jel elektroforez de dahil olmak üzere sıkı arıtma şemaları protein ve RNA molekülleri bir araya getiriyor. Yüksek verim sıralama teknolojileri ile birlikte, CLIP, protein-RNA genom ölçekte etkileşimler (HITS-CLIP veya CLIP-seq olarak ^{anılacaktır)} 9,10 çalışmak için güçlü bir araç olarak kanıtlamıştır . Son zamanlarda, PAR-CLIP ^11,12 çapraz bağlama photoreactive ribonükleozit analogları kullanan sunuldu.

Elde edilen verilerin yüksek özgüllüğü karşın, CLIP deneyler genellikle sınırlı sıra karmaşıklığı cDNA kütüphaneleri oluşturmak. Bu co-saflaştırılmış RNA kısıtlı miktarda ve kütüphane hazırlanması için gerekli olan iki verimsiz RNA ligasyonu reaksiyonlar kısmen. Buna ek olarak, astar uzatma testlerinde birçok cDNAs çapraz nükleotid ¹³ erken kesmek olduğunu belirtti. Bu kesilmiş cDNAs standart CLIP kütüphane hazırlık protokolü sırasında kaybolur. Biz son zamanlarda daha etkin bir molekül cDNA circularization (Şekil 1) ¹⁴ ile verimsiz intermoleküler RNA ligasyonu adımları değiştirerek kesilmiş cDNAs yakalar iCLIP (bireysel nükleotid çözünürlük CLIP) geliştirdi. Önemlisi, kesilmiş cDNAs sıralama nükleotid çözünürlükte çapraz bağ sitenin konumu içgörüler sağlar. Biz iCLIP genom ölçekte hnRNP C parçacık organizasyonun başarılı bir çalışma ^ve 14 ekleme düzenleme rolünü değerlendirmek için uygulanır .

Protocol

1. UV çapraz bağlayarak hücreleri, doku kültürü

1. Ortamı çıkarın ve 10 cm plaka (üç deneyler için yeterli) yetiştirilen hücreler 6 ml buz gibi soğuk PBS ekleyin.
2. Kapak ve buz üzerinde yer çıkarın. 150 254 nm'de mJ / cm ² ile bir kere ışın tedavisi.
3. Bir hücre kaldırıcı kazıma hücreleri tarafından Hasat.
4. 2 ml hücre süspansiyonu, her üç mikrotüpler aktarın. 10 saniye boyunca en yüksek hızda Spin 4 ° C pelet hücrelerine, daha sonra süpernatant kaldırmak.
5. Snap-, donma -80, kuru buz ve mağaza hücre pelet ° C kullanana kadar.

2. Boncuk hazırlık

1. 100 protein ul taze bir mikrotüp Deneme başına Dynabeads (Dynal 100,02) (fare veya keçi antikorları için protein G Dynabeads kullanın).
2. 2x boncuk lizis tamponu (100 mM NaCl,% 1 NP-40,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın; 1 / 100 proteaz inhibitörü kokteyl III Calbiochem 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile yıkayın
3. 2-10 mg antikor ile 100 ul lizis tamponu boncuk tekrar
4. Oda sıcaklığında 30-60 dk tüpler döndürün.
5. 900 ul lizis tamponu ile 3x yıkayın ve son yıkama 4.1 adım ilerlemek için hazır olana kadar bekletin.

3. Hücre parçalama ve kısmi RNA sindirim

1. 1 ml lizis tamponu ve 1.5 ml mikrotüp transfer hücre pelletini tekrar.
2. RNaz (Ambion, AM2295) 1 / 500 dilüsyon hazırlayın. [10 ul RNaz I seyreltme yanı sıra hücre lizat 2 ul Turbo DNaz ekle (1 / 500 RNaz I dilüsyonları düşük RNaz] kütüphane hazırlanması için kullanılır; 1 / 50 dilüsyonları [yüksek RNaz] antikor özgüllüğü kontrol etmek için gerekli) .
3. Tam 3 dakika 37 ° ° C, 1.100 rpm'de sallayarak örnekleri inkübe edin. Hemen buz transfer.
4. 4 Spin ° C ve lizat temizlemek için 20 dakika süreyle 22.000 gr. Dikkatle (pelet ile yaklaşık 50 ul lizat bırakın) süpernatantı toplamak.

4. Immunoprecipitation

1. Boncuk (2.5 adım) yıkama tamponu çıkarın, daha sonra hücre lizat (3.4 adım) ekleyin.
2. 2 saat için 4 örnekleri Döndür ° C
3. Süpernatantı atın ve 900 ul yüksek tuz tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 M NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın) 2x boncuk yıkayın.
4. 900 ul yıkama tamponu (10 mM MgCl _2;% 0.2 Tween-20 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile yıkayın 2x

5. RNA 3'ends, Defosforilasyon

1. Süpernatant atın ve 20 ul PNK karışımı boncuklar tekrar süspansiyon (15 ul su; 4 ul 5x PNK pH 6.5 tamponu [350mMTris-HCl, pH 6.5; 50mMMgCl ₂ 25mMdithiothreitol]; 0.5 ul PNK enzim; 0.5 ul RNasin [Promega]).
2. 37 20 dakika boyunca inkübe ° C.
3. 500 ul yıkama tamponu ekleyin ve 1x yüksek tuz tamponu ile yıkayın.
4. Yıkama tamponu ile 2x yıkayın.

6. 3 'uçları RNA Linker ligasyonu

1. Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve (9 ul su 20 ul ligasyon karışımı boncuklar tekrar süspansiyon; 4 ul 4x ligasyonu tampon [200 mMTris-HCl, 40 MM GCL _2; 40 mM dithiothreitol]; 1 ul RNA ligaz [NEB]; 0.5 ul RNasin [Promega]; 1.5 ul-adenylated öncesi linker L3 [20 mcM]; 4 ul PEG400 [81.170, Sigma]).
2. 16 yaşında bir gece inkübe ° C
3. 500 ul yıkama tamponu ekleyin ve sonra 1 ml yüksek tuz tamponu ile 2x yıkayın.
4. Ikinci yıkama 1 ml 1 ml yıkama tamponu ile 2x ve terk yıkayın.

7. RNA 5 'sonuna etiketleme

1. Süpernatantı ve 8 ul PNK sıcak karışımı boncuklar tekrar süspansiyon (0.4 ul PNK [NEB]; 0.8 ul ³² P-γ-ATP; 0.8 ul 10x PNK tampon [NEB]; 6 ul su).
2. 37 5 dakika boyunca inkübe ° C.
3. Sıcak PNK karışımı çıkarın ve 20 ul 1x Nupage yükleme tamponu (Invitrogen) boncuk tekrar süspansiyon.
4. 70 ° C'de 10 dakika süreyle bir Thermomixer inkübe edin.
5. Hemen boş boncuklar (bkz. adım 8) hızlandırabilir ve jel süpernatantı yüklemek için bir mıknatıs yer.

8. SDS-PAGE ve membran transferi

1. % 4-12 NuPAGE üreticinin talimatlarına göre Bis-Tris jel (Invitrogen) numuneleri yükleyin. Tamponu (Invitrogen) 1x MOPS 0,5 l kullanın. Ayrıca bir ön-lekeli protein boyutu işaretleyici (örneğin SAYFA hükümdarı artı Fermentas, SM1811) 5 ul yük.
2. 50 dakika için 180 jel çalıştırın V.
3. Jel ön çıkarın ve katı atık (ücretsiz radyoaktif ATP içerir) olarak atın.
4. Jel (Invitrogen, transferi 1 saat 30 V), üreticinin talimatlarına göre Novex ıslak transfer aparatları kullanarak bir nitroselüloz membran protein-RNA kompleksleri aktarın.
5. Aktarımdan sonra, PBS membran durulama, Saran wrap sonra sarın ve -80 ° C (yerinde daha sonra t hizalamak için membran yanında bir floresan etiket Fuji film maruzo film ve membran) 30 dakika, 1 saat ve gece boyunca maruz kalma gerçekleştirmek.

9 - RNA izolasyonu

1. , Bir maske olarak 8.5 adım autoradiograph kullanarak düşük RNaz deney protein-RNA kompleksleri izole edin. Bu parça membran birkaç küçük dilimler halinde kesin ve 1.5 ml mikrotüp içine yerleştirin.
2. Ve 10 ul proteinaz K (Roche, 03115828001) 200 ul PK tamponu (10 mM EDTA; 50 mM NaCl 100 mM Tris-HCl pH: 7.4), membran parçaları ekleyin. 1.100 rpm'de 20 dakika süreyle 37 ° sallayarak inkübe ° C
3. PKurea tamponu (50 mM NaCl; 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH: 7.4 7 M üre) 200 ul ekleyin ve 37 ° 20 dakika boyunca inkübe ° C.
4. Çözüm toplayın ve 2 ml Phase Lock Gel Ağır tüp (713-2536, VWR) kloroform (Ambion 9722) / fenol RNA 400 ul ile birlikte ekleyin.
5. 1,100 rpm hızında titreme, 5 dakika 30 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 13.000 rpm'de 5 dakika boyunca iplik aşamaları ayırın.
6. (Jel pipet ile dokunmamaya dikkat), yeni bir tüp içine sulu aktarın. 0.5 ul glycoblue (Ambion 9510) ve 40 ul 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin. Daha sonra 1 ml% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti

10 Ters transkripsiyon

1. Spin 20 dakika için 15,000 rpm ve 4 ° C Süpernatantı ve pelet 0.5 ml% 80 etanol ile yıkayın.
2. 7.25 ul RNA / astar karışımı (0.5 ul Rclip astar [0.5pmol/μl]; 0.5 ul dNTP mix [10mM] 6.25 ul su) pelletini tekrar Her deney ya da çoğaltmak için, ayrı ayrı barkod dizileri (14) içeren farklı bir Rclip astar kullanın.
3. 5 dakika 70 ° C'de 25 ° C'ye kadar soğutma önce
4. 2.75 ul RT karışımı (0.5 ul 0.1M DTT; 0.25 ul Üstsimge III ters transkriptaz [Invitrogen] 2 ul 5x RT tampon) ekleyin.
5. 5 dakika 25 ° C'de 20 dakika, 42 ° C, 40 dakika 50 ° C ve 5 dakika 80 ° C 4 soğutma ° C.
6. 90 ul TE tampon, 0.5 ul glycoblue ve 10 ul sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin. Sonra 250 ul% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti

11. CDNA, Jel arıtma

1. Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 6 su ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
2. 6 ul 2x TBE üre yükleme tamponu (Invitrogen) ekleyin. Isı örnekleri 80 ° C doğrudan yüklemeden önce 3 dk.
3. Bir prekast% 6 TBE üre jel (Invitrogen) numuneleri yükleyin ve üretici tarafından açıklandığı gibi 180 V 40 dakika çalıştırın. Ayrıca bir sonraki kesim için (aşağıya bakın) düşük molekül ağırlıklı işaretleyici yükleyin.
4. 120-200 nt (yüksek), 85-120 nt (orta) ve 70-85 nt (düşük) az üç bantlarını. (Bkz. Şekil 3) eksizyon kılavuzu theupper boya ve plastik jel destek işaretleri kullanın. CLIP dizisi 52 nt Rclip astar ve birlikte L3 dizisi hesabı unutmayın.
5. 400 ul TE ekleyin ve 1 ml şırınga pistonu kullanarak küçük parçalar halinde jel dilim ezmek. 37 az 2 saat süreyle 1.100 rpm'de sallayarak inkübe ° C
6. Costar SpinX sütun (Corning Incorporated, 8161) içine iki adet 1 cm cam ön filtreler (whatman 1.823.010) yerleştirin. Sütun örnek sıvı kısmı aktarın. 1 dakika için 1.5 ml tüp içine 13.000 devirde dönerler.
7. 0.5 ul glycoblue ve 40 ul sodyum asetat pH 5.5, daha sonra örnek karıştırın. 1 ml% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti

12. CDNA 5'end astar ligasyonu

1. Inkübe aşağı Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 8 ul ligasyon karışımı (0.8 ul 10x CircLigase Tampon II; 0.4 ul 50 mM MnCl _2; 0.3 ul Circligase II [Epicentre] 6.5 ul su) pelet tekrar süspansiyon 60 ° C'de 1 saat
2. 30 ul oligo tavlama karıştırın (26 ul su; 3 ul FastDigest Tampon [Fermentas]; 1 ul cut_oligo [10 mcM]). 1 dakika boyunca inkübe 95 ° C Sonra her 20 saniyede 1 sıcaklığını azaltmak ° C 25 kadar ° C ulaşılır.
3. 37 ° 2 ul BamHI (Hızlı Fermentas) ve 30 dakika boyunca inkübe ° C
4. 50 ul TE ve 0.5 ul glycoblue ve karışımı ekleyin. 10 ul sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin, daha sonra 250 ul% 100 etanol ekleyin. -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti

13. PCR

1. Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 19 ul su pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
2. (; 1 ul astar karışımı P5/P3 solexa, her 10 mcM; 20 ul Accuprime Supermix 1 enzim [Invitrogen] 19 ul cDNA) PCR karışımı hazırlayın.
3. Aşağıdaki PCR programı çalıştırın: _{25-35 döngüleri,} 68 ° C 'de 3 dakika, 4 [30 saniye 15 saniye, 65 ° C - 94 ° C için 30 saniye, 68 ° C] 94 ° C' de 2 dakika süreyle, ° C sonsuza dek.
4. 8 ul PCR ürün karması bir prekast% 6 TBE jel 5x TBE yükleme tamponu ve yük 2 ul (Invitstresin). Leke Sybrgreen I (Invitrogen) jel ve jel görüntüleme cihazı ile analiz.
5. Rclip primerler barkod yüksek verimlilik sıralaması için göndermeden önce multipleks farklı örnekleri izin verir. Kütüphane sıralaması için 15 ul gönderin ve geri kalanı saklamak.

14. Linker ve astar dizileri

Ön adenylated 3 'linker DNA:

[20μM hacimde yapabilir sonra IDT gelen DNA bağdaştırıcısı sipariş.]

15. Temsilcisi Sonuçlar:

Deneyinin başarısı için, iCLIP kütüphane sıralanması önce iki adım izlenebilir: autoradiograph membran transferinden sonra protein-RNA kompleksi (adım 8.5) ve PCR ürünlerinin jel (adım 13.4). Düşük RNaz örnekleri autoradiograph, diffüz radyoaktivite protein (Şekil 2, örnek 4) moleküler ağırlığı üzerinde görülmelidir. Yüksek RNaz örnekleri için, bu radyoaktivite yakın proteinin moleküler ağırlığı (Şekil 2, Örnek 3) odaklanmıştır. Hiçbir antikor immunoprecipitation kullanıldığında, herhangi bir sinyal (Şekil 2, 1 ve 2 örnekleri) tespit edilmelidir. Immunoprecipitation özgüllüğü için daha önemli kontrol UV ışını veya ilgi ¹⁴ protein ifade kullanımı hücrelerin atlarsanız ya.

PCR ürünleri (adım 13.4) jel görüntü adım 11.4 (Şekil 4, şerit 4-6) saflaştırılmış cDNA fraksiyonu (yüksek, orta veya düşük) karşılık gelen bir boyut aralığı göstermelidir. PCR primerleri P3Solexa ve P5Solexa cDNA boyutu için ek bir 76 nt tanıtmak olduğunu unutmayın. Hiçbir antikor immunoprecipitation sırasında kullanılması durumunda, hiçbir karşılık gelen PCR ürünleri (Şekil 4, şerit 1-3) tespit edilmelidir. Primer-dimer ürün yaklaşık 140 nt az görünebilir.

^14, yüksek verimlilik sıralama ve daha sonraki biyoinformatik analizleri temsilcisi sonuçlar için bkz .

Şekil 1 iCLIP protokolü şematik. Protein-RNA kompleksleri UV ışını (adım 1) kullanarak in vivo kovalent çapraz bağlanır. Ilgi protein bağlı RNA (adım 2-5) ile birlikte arındırılır. Ters transkripsiyon sıra özel astar izin vermek için, sonunda radyoaktif (adım 6 ve 7) etiketli bir RNA adaptörü 5 iken, RNA sonu 3 bağlandı. Çapraz bağlı protein-RNA kompleksleri, SDS-PAGE ve membran transferi (adım 8) kullanarak ücretsiz RNA arınmış. RNA protein sindiren proteinaz K nükleotid çapraz bağ (adım 9) kalan bir polipeptid bırakarak membrandan kurtarıldı. Ters transkripsiyon (RT) kalan polipeptid keser ve iki cleavable adaptör bölgeler ve barkod dizileri (adım 10) tanıttı. Boyutu seçimi circularization önce ücretsiz RT astar kaldırır. Aşağıdaki doğrusallaştırma PCR amplifikasyonu için uygun şablonları (adım 11-15) üretir. Son olarak, yüksek verimli sıralama barkod dizileri hemen (adım 16) cDNA son nükleotid tarafından takip edilmektedir hangi okur üretir. Çapraz bağlı nükleotid upstream bu nükleotid bulur bir konum bu yana, bağlama site, yüksek çözünürlüğe sahip çıkarılabilir.

Şekil 2 çapraz bağlantılı hnRNP C-RNA kompleksleri Autoradiograph denatüre jel elektroforezi ve membran transferi kullanarak. hnRNP C-RNA kompleksleri hücre özleri hnRNP C'ye karşı bir antikor kullanarak immüno-saflaştırılmış (α hnRNP C, örnekleri 3 ve 4). RNA kısmen düşük (+) veya yüksek kullanılarak sindirilir (+ +) konsantrasyonu RNaz. Proteinin büyüklüğü (40 kDa) yukarı doğru kayması Kompleksleri (örnek 4) görülebilir. RNaz yüksek konsantrasyonlarda (örnek 3) kullanılan zaman kayması daha az belirgindir. Herhangi bir antikor (örnekler 1 ve 2) immunoprecipitation kullanılan radyoaktif bir sinyal kaybolur.

Şekil 3 şematik% 6 TBE-üre jel (Invitrogen) iCLIP cDNA ürünleri eksizyon kılavuzu. Jel, jel cDNAs ve boyalar (mavi ışık ve karanlık) tekrarlanabilir bir göç desen önde gelen 180 V 40 dakika çalıştırın. (Kırmızı çizgi), yüksek (H), orta (M), ve düşük (L) cDNA kesirler kesmek için jilet kullanın. Ortasında açık mavi boya ve plastik jel kaset işareti hemen üzerinde keserek başlayın. Orta ve düşük kesirler Böl ve yaklaşık 1 cm yukarıda açık mavi boya yüksek bir kısmını düzeltin. Farklı şerit (Bu örnekte 1-4) ayırmak için cepler ve boya tarafından yönlendirilen dikey kesikler kullanın. Işaretleyici şeritli (m) lekeli ve kontrol görüntülü olabilirkestikten sonra boyutları. Fragment boyutları sağ tarafta gösterilir.

Şekil 4 jel elektroforezi kullanılarak PCR-amplifiye iCLIP cDNA kütüphaneleri analizi. RNA ters transkripsiyonu ve boyut-saflaştırılmış denatüre jel elektroforezi (Şekil 2) kullanarak membran (Şekil 1) kurtarıldı. Üç boyut fraksiyonları cDNA (yüksek [H]: 120-200 nt, orta [M]: 85-120 nt ve düşük [L]: 70-85 nt) ele geçirilmiştir circularized, yeniden lineerleştirilmiş ve PCR-amplifiye. Farklı boyut dağılımı PCR ürünleri giriş fraksiyonları farklı boyutlarda bir sonucu olarak görülebilir. PCR primer cDNA 76 nt bu yana, orta ve küçük boyut fraksiyonları için 146-161 nt boyutları, yüksek, 161-196 nt, 196-276 nt arasında aralık olmalıdır. Hiçbir antikor immunoprecipitation (şerit 1-3) için kullanılan PCR ürünleri bulunmaz.

Discussion

ICLIP protokolü enzimatik reaksiyonları ve saflaştırma adımları çok çeşitli içerdiğinden, bir deney başarısız bir sorun tespit etmek her zaman kolay değildir. Spesifite tespit RNA çapraz bağ siteleri kontrol etmek için, bir veya daha fazla negatif kontroller tam bir deney ve sonraki hesaplama analizleri boyunca muhafaza edilmelidir. Bu kontroller, no-antikor örnek, çapraz bağlantılı olmayan hücreler, ya da nakavt hücre veya doku gelen immunoprecipitation olabilir. İdeal olarak, bu kontrol deneyleri herhangi bir protein-RNA kompleksleri arındırmak gerekir, ve bu nedenle, SDS-PAGE jel üzerinde hiçbir sinyal ve PCR sonra saptanabilir ürün vermelidir. Bu kontrol kütüphaneler Yüksek throughput sıralama çok az benzersiz dizileri dönmelidir. Sonuçlanan dizileri hala, küçük miktarlarda demonte hücrelerden arındırılır aynı protein, çapraz bağ sitelerine karşılık beri demonte hücreleri, bir sıralama kontrolü olarak tavsiye edilmez.

Önlemler de önceki deneylerden elde edilen PCR ürünleri ile kirlenmesini önlemek için alınmalıdır. Bu sorunu en aza indirmek için en iyi yolu, pre-ve post-PCR adımları mekansal ayrı. İdeal olarak, PCR ürünleri ve sonraki tüm adımları analizi ayrı bir odada yapılmalıdır. Ayrıca, laboratuvarda her üye, tamponlar ve diğer reaktifler kendi kullanmalıdır. Bu şekilde, kirlenme kaynakları daha kolay tespit edilebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands