iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

Summary

De ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten op een transcript is een belangrijke determinant van post-transcriptionele regulatie. Daarom ontwikkelden we de individuele-nucleotide resolutie van UV-crosslinking en immunoprecipitatie (iClip) dat precieze genoom-brede kartering van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit maakt.

Abstract

De unieke samenstelling en ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten (RBPs) op een transcript gids de diverse aspecten van de post-transcriptionele regulatie ^1. Daarom is een essentiële stap om het transcript regelgeving op het moleculaire niveau is het positionele informatie te verkrijgen over de bindingsplaatsen van RBPs ^2.

Eiwit-RNA interacties kunnen bestudeerd worden met behulp van biochemische methoden, maar deze benaderingen niet te pakken RNA verbindend in al haar oorspronkelijke cellulaire context. De eerste pogingen om eiwit-RNA complexen studie in hun cellulaire omgeving werkzaam affiniteitszuivering of immunoprecipitatie gecombineerd met differentieel display of microarray analyse (RIP-CHIP) ^3-5. Deze benaderingen waren gevoelig voor het identificeren van indirecte of niet-fysiologische interacties ^6. Om de specificiteit en positionele resolutie te verhogen, een strategie om als CLIP (UV cross-linking en immunoprecipitatie) werd geïntroduceerd ^7,8 verwezen. CLIP combineert UV-cross-linking van eiwitten en RNA-moleculen met strenge zuivering's waaronder denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. In combinatie met een high-throughput sequencing technologieën, is CLIP bewezen als een krachtig instrument om eiwit-RNA-interacties op een genoom-brede schaal (aangeduid als HITS-CLIP of CLIP-seq) ^9,10 te bestuderen. Onlangs werd PAR-CLIP geïntroduceerd die fotoreactief ribonucleoside analogen gebruikt voor cross-linking ^11,12.

Ondanks de hoge specificiteit van de verkregen gegevens, CLIP experimenten genereren vaak cDNA-bibliotheken van de beperkte reeks complexiteit. Dit is deels te wijten aan de beperkte hoeveelheid co-gezuiverd RNA en de twee inefficiënte RNA ligatiereacties die nodig is voor bibliotheek voorbereiding. Daarnaast, primer extensie assays aangegeven dat veel cDNA's voortijdig kappen op de verknoopte nucleotide ^13. Dergelijke afgekapt cDNA's zijn verloren tijdens de standaard CLIP bibliotheek voorbereiding protocol. We hebben recent ontwikkelde iClip (individuele-nucleotide resolutie CLIP), die de afgeknotte cDNA's vangt door het vervangen van een van de inefficiënte intermoleculaire RNA ligatie stappen met een meer efficiënte intramoleculaire cDNA circularization (figuur 1) ^14. Belangrijk is dat sequencing de afgeknotte cDNA's geeft inzicht in de positie van de cross-link site op nucleotide resolutie. Wij hebben met succes toegepast iClip op hnRNP C deeltje organisatie op een genoom-brede schaal onderzoek en de rol ervan te beoordelen in splicing voorschrift ^14.

Protocol

1. UV verknoping van weefselcultuurcellen

1. Verwijder de media en voeg 6 ml ijskoude PBS aan cellen gekweekt in een 10 cm plaat (genoeg voor drie experimenten).
2. Verwijder het deksel en plaats op ijs. Bestralen een keer met 150 mJ / cm ² bij 254 nm.
3. Oogst de cellen door schrapen met een cel lifter.
4. Breng 2 ml celsuspensie aan elk van de drie microbuisjes. Draaien op topsnelheid voor 10 sec bij 4 ° C tot pellet cellen, verwijder supernatant.
5. Snap-vries de cel pellets op droog ijs en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.

2. Bead voorbereiding

1. Voeg 100 ul van proteïne A Dynabeads (Dynal, 100,02) per experiment een nieuwe microbuisjes (Gebruik proteïne G Dynabeads voor een muis of een geit antilichamen).
2. Was kralen 2x met lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat; honderdste proteaseremmer cocktail III, Calbiochem).
3. Resuspendeer kralen in 100 ul lysisbuffer met 2-10 ug antilichaam.
4. Draai buizen bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten.
5. Was 3x met 900 ul lysis buffer en laat in de laatste wasbeurt tot klaar om verder te gaan 4,1 stap.

3. Cellysis en gedeeltelijke RNA spijsvertering

1. Resuspendeer de celpellet in 1 ml lysis buffer en transfer naar 1,5 ml microbuisjes.
2. Bereid een 1 / 500 verdunning van RNase I (Ambion, AM2295). Voeg 10 pi RNase ik verwatering evenals 2 pi Turbo DNase de cel lysaat (1 / 500 RNase ik verdunningen [lage RNase] worden gebruikt voor bibliotheken voorbereiding; 1 / 50 verdunning [hoge RNase] nodig zijn om de controle voor de antilichaamspecificiteit) .
3. Incubeer de monsters voor exact 3 min bij 37 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Onmiddellijk over te dragen aan ijs.
4. Spin bij 4 ° C en 22.000 g gedurende 20 minuten aan het lysaat te wissen. Zorgvuldig verzamelen supernatant (laat ongeveer 50 ui lysaat met de pellet).

4. Immunoprecipitatie

1. Verwijder de wasbuffer van de kralen (uit stap 2.5) en voeg vervolgens de cel lysaat (vanaf stap 3.4).
2. Draai de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C.
3. Verwijder het supernatant en was de kralen 2x met 900 ul high-zout-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS; 0,5% natriumdeoxycholaat).
4. Was 2x met 900 ul wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM _MgCl2, 0,2% Tween-20).

5. Defosforylatie van RNA 3'ends

1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl PNK mix (15 ul water; 4 il 5x PNK pH 6,5 buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl ₂ 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK enzym; 0,5 ul RNasin [Promega]).
2. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
3. Voeg 500 ul wasbuffer en was 1x met een hoge-zout buffer.
4. Was 2x met wasbuffer.

6. Linker ligatie naar 3 'uiteinden RNA

1. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de parels in 20 pl ligatie mix (9 ul water; 4 pi 4x ligatiebuffer [200 mMTris-HCl; 40m MM GCL _2, 40 mM dithiothreitol]; een ul RNA-ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]).
2. Incubeer overnacht bij 16 ° C.
3. Voeg 500 ul wasbuffer en dan 2x wassen met 1 ml high-zout buffer.
4. Was 2x met 1 ml wasbuffer en laat in 1 ml van het tweede wassen.

7. RNA 5 'uiteinde etikettering

1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 8 pl van hot PNK mix (0,4 ul PNK [NEB]; 0,8 ul ³² P-γ-ATP; 0,8 pl 10x PNK buffer [NEB]; 6 ul water).
2. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
3. Verwijder de hete PNK mix en resuspendeer de parels in 20 pl 1x Nupage laadbuffer (Invitrogen).
4. Incubeer op een Thermomixer bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
5. Direct plaats op een magneet voor het neerslaan van de lege kralen en het supernatant belasting op de gel (zie stap 8).

8. SDS-PAGE en membraan overdracht

1. Laad de monsters op een 4-12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 0,5 l 1x MOPS lopen buffer (Invitrogen). Ook laden 5 ul van een pre-gekleurde eiwit size marker (bijvoorbeeld PAGE heerser plus, Fermentas, SM1811).
2. Laat de gel gedurende 50 minuten op 180 V.
3. Verwijder de gel voor-en gooi als vast afval (bevat gratis radioactief ATP).
4. Breng de eiwit-RNA-complexen van de gel tot een nitrocellulose membraan met behulp van de Novex natte overdracht inrichting volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, overdracht 1 uur bij 30 V).
5. Na de overdracht, het membraan in PBS-buffer spoelen, dan wikkel het in Saran Wrap en blootstellen aan een Fuji film bij -80 ° C (plaats een fluorescerende sticker naast het membraan om later af te stemmen thij film en het membraan, uit te voeren blootstelling gedurende 30 minuten, 1 uur en 's nachts).

9. RNA-isolatie

1. Isoleer de eiwit-RNA-complexen van de lage-RNase experiment met de autoradiogram uit stap 8.5 als een masker. Snijd dit stukje membraan in verschillende dunne plakjes en leg ze in een 1,5 ml microbuisjes.
2. Voeg 200 ul PK buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) en 10 ul proteinase K (Roche, 03115828001) om het membraan stukken. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 20 min bij 37 ° C.
3. Voeg 200 ul van PKurea buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M ureum) en voor 20 min bij 37 ° C. incubeer
4. Verzamel de oplossing en voeg deze samen met 400 ul van RNA fenol / chloroform (Ambion, 9722) om een ​​2 ml Phase Lock Gel Heavy buis (713 tot 2536, VWR).
5. Incubeer 5 min bij 30 ° C, schudden bij 1.100 tpm. Scheid de fasen door het draaien gedurende 5 minuten bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur.
6. Breng de waterlaag in een nieuwe buis (pas op voor de gel contact met de pipet). Voeg 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) en 40 pi 3 M natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C.

10. Reverse transcriptie

1. Spin gedurende 20 min bij 15000 rpm en 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de pellet met 0,5 ml 80% ethanol.
2. Resuspendeer de pellet in 7,25 ul RNA / primer mix (6,25 ul water; 0,5 ul Rclip primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP mix [10 mM]). Voor elk experiment of te repliceren, gebruik een andere Rclip primer met individuele barcode sequenties (zie 14).
3. Incubeer 5 minuten bij 70 ° C te koelen tot 25 ° C.
4. Voeg 2,75 ul RT mix (2 pi 5x RT buffer; 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III reverse transcriptase [Invitrogen]).
5. Incubeer 5 min bij 25 ° C, 20 min bij 42 ° C, 40 min bij 50 ° C en 5 minuten bij 80 ° C te koelen tot 4 ° C.
6. Voeg 90 ul TE-buffer, 0,5 ul glycoblue en 10 pl natriumacetaat pH 5,5 en meng. Voeg vervolgens 250 ul 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C.

11. Gel zuivering van cDNA

1. Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 6 pi van water.
2. Voeg 6 pl 2x TBE-ureum laadbuffer (Invitrogen). Warmte monsters tot 80 ° C gedurende 3 minuten direct voor het laden.
3. Laad de monsters op een prefab 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) en een looptijd van 40 minuten op 180 V, zoals beschreven door de fabrikant. Ook laden een laag moleculair gewicht marker voor latere snijden (zie hieronder).
4. Snijd drie bands op 120 tot 200 nt (hoog), 85-120 nt (medium) en 70-85 nt (laag). Gebruik theupper kleurstof en de markeringen op de plastic gel steun aan excisie gids (zie figuur 3). Merk op dat de Rclip primer en de L3 volgorde zijn samen goed voor 52 nt van de CLIP-reeks.
5. Voeg 400 ul TE en plet de gel plak in kleine stukjes met behulp van een 1 ml spuit zuiger. Incubeer schudden bij 1100 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C.
6. Plaats twee 1 cm glas pre-filters (Whatman, 1.823.010) in een Costar Sphinx kolom (Corning Incorporated, 8161). Breng de vloeibare deel van het monster op de kolom. Spin voor een min bij 13000 rpm in een 1.5 ml buis.
7. Voeg 0,5 il glycoblue en 40 pi natriumacetaat pH 5,5, en meng het monster. Voeg 1 ml 100% ethanol, meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C.

12. Ligatie van primer aan het 5'-uiteinde van het cDNA

1. Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellets in 8 pi ligatie mix (6,5 ul water; 0,8 pl 10x CircLigase Buffer II; 0,4 ul 50 mM MnCl _2, 0,3 ui, Circligase II [Epicentre]) en incubeer gedurende 1 uur bij 60 ° C.
2. Voeg 30 ul oligo gloeien mix (26 ul water; 3 pl FastDigest Buffer [Fermentas]; 1 pi cut_oligo [10 uM]). Incubeer gedurende 1 min op 95 ° C. Vervolgens de temperatuur te verlagen om de 20 seconden met 1 ° C tot 25 ° C worden bereikt.
3. Voeg 2 pl BamHI (Fast Fermentas) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
4. Voeg 50 ul TE en 0,5 pl glycoblue en meng. Voeg 10 ul natriumacetaat pH 5,5 en mix, voeg 250 ul 100% ethanol. Meng opnieuw en neerslag gedurende de nacht bij -20 ° C.

13. PCR-amplificatie

1. Spin down en was de monsters (zie 10.1), dan resuspendeer de pellet in 19 ul water.
2. Bereid de PCR-mix (19 ul cDNA, 1 ui primer mix P5/P3 Solexa, 10 pM elk; 20 ul Accuprime Supermix een enzym [Invitrogen]).
3. Voer de volgende PCR-programma: 94 ° C gedurende 2 minuten, [94 ° C gedurende 15 sec, 65 ° C gedurende 30 sec, 68 ° C gedurende 30 sec] _{25-35 cycli,} 68 ° C gedurende 3 min, 4 ° C voor altijd.
4. Mix 8 ul PCR-product met 2 pi van 5x TBE laadbuffer en de belasting op een prefab 6% TBE gel (InvitRogen). Vlekken op de gel met Sybrgreen I (Invitrogen) en te analyseren met een gel imager.
5. De barcode op de Rclip primers laten multiplex verschillende monsters vóór het indienen van voor high throughput sequencing. Submit 15 ul van de bibliotheek voor sequencing en sla de rest.

14. Linker en primer sequenties

Pre-adenylated 3 'linker DNA:

[We bestellen het DNA-adapter van IDT en vervolgens fracties van 20μM.]

15. Representatieve resultaten:

Voorafgaand aan de opeenvolging van de iClip bibliotheek, kan het succes van het experiment te worden gecontroleerd op twee stappen: het autoradiogram van het eiwit-RNA-complex na het membraan transfer (stap 8.5) en de gel imago van de PCR-producten (stap 13.4). In de autoradiogram van de lage-RNase monsters moeten diffuse radioactiviteit te zien boven het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, monster 4). Voor high-RNase samples, is deze radioactiviteit dichter bij het molecuulgewicht van het eiwit (figuur 2, voorbeeld 3) gericht. Als er geen antilichaam wordt gebruikt in de immunoprecipitatie, zou er geen signaal worden gedetecteerd (Figuur 2, monsters 1 en 2). Andere belangrijke controles voor de specificiteit van de immunoprecipitatie of weglaten UV-straling of gebruik cellen die niet uitdrukken het eiwit van belang ^14.

De gel beeld van de PCR-producten (stap 13.4) moet tonen een groot bereik dat overeenkomt met het cDNA fractie (hoog, gemiddeld of laag) gezuiverd in stap 11.4 (figuur 4, lanen 4-6). Merk op dat de PCR-primers P3Solexa en P5Solexa een extra 76 nt kennis maken met de grootte van de cDNA. Als er geen antilichaam wordt gebruikt tijdens de immunoprecipitatie, mag geen overeenkomstige PCR-producten worden gedetecteerd (Figuur 4, lanen 1-3). Primer dimeer product kan verschijnen op ongeveer 140 nt.

Voor representatieve resultaten van high-throughput sequencing en de daarop volgende bioinformatica analyses zie ^14.

Figuur 1. Schematische weergave van de iClip protocol. Eiwit-RNA complexen covalent verknoopt in vivo met behulp van UV-bestraling (stap 1). Het eiwit van belang is samen gezuiverd met het gebonden RNA (stappen 2-5). Te zorgen voor sequentie-specifieke priming van de reverse transcriptie, is een RNA-adapter geligeerd aan het 3 'uiteinde van het RNA, terwijl het 5' einde is radioactief gelabeld (stappen 6 en 7). Cross-linked eiwit-RNA-complexen zijn gezuiverd van de gratis RNA met behulp van SDS-PAGE en membraan transfer (stap 8). Het RNA wordt teruggewonnen uit het membraan door het verteren van het eiwit met proteinase K het verlaten van een polypeptide blijven bij de cross-link nucleotide (stap 9). Reverse transcriptie (RT) afgekapt bij de resterende polypeptide en introduceert twee splitsbaar adapter regio's en barcode sequenties (stap 10). Maat selectie verwijdert gratis RT-primer voor circularization. De volgende linearisatie genereert geschikt voor de PCR-amplificatie (stap 11-15). Tot slot, high-throughput sequencing genereert leest waarin de barcode sequenties onmiddellijk gevolgd door de laatste nucleotide van het cDNA (stap 16). Aangezien dit nucleotide lokaliseert een positie stroomopwaarts van de cross-linked nucleotide, kan de bindingsplaats worden afgeleid met een hoge resolutie.

Figuur 2. Autoradiogram van cross-linked hnRNP C-RNA complexen met behulp van denaturerende gelelektroforese en membraan overdracht. hnRNP C-RNA complexen werden immuno-gezuiverd van cel extracten met behulp van een antilichaam tegen hnRNP C (α hnRNP C, monsters 3 en 4). RNA werd gedeeltelijk verteerd met behulp van een laag (+) of hoge (+ +) concentratie van RNase. Complexen verschuiving naar boven van de grootte van het eiwit (40 kDa) kan worden waargenomen (voorbeeld 4). De verschuiving is minder uitgesproken bij hoge concentraties van RNase werden gebruikt (voorbeeld 3). Het radioactieve signaal verdwijnt wanneer er geen antilichaam werd gebruikt in de immunoprecipitatie (monsters 1 en 2).

Figuur 3. Schematische 6% TBE-ureum gel (Invitrogen) om de excisie van iClip cDNA-producten gids. De gel wordt gerund gedurende 40 minuten op 180 V leidt tot een reproduceerbare migratiepatroon van cDNA's en kleurstoffen (licht en donker blauw) in de gel. Gebruik een scheermesje te snijden (rode lijn) de hoge (H), medium (M) en laag (L) cDNA fracties. Begin met het snijden in het midden van de licht blauwe kleurstof en vlak boven de markering op de plastic gel cassette. Verdeel het medium en de lage fracties en trim de hoge fractie ongeveer 1 cm boven de licht blauwe kleurstof. Gebruik verticaal snijdt laten leiden door de zakken en de kleurstof om de verschillende rijstroken (in dit voorbeeld 1-4) te scheiden. De marker baan (m) kan worden gekleurd en afgebeeld onder controlematen na het snijden. Fragment maten zijn aangegeven op de rechterkant.

Figuur 4. Analyse van PCR-geamplificeerd iClip cDNA-bibliotheken met behulp van gelelektroforese. RNA hersteld van het membraan (figuur 1) was omgekeerd getranscribeerd en de grootte-gezuiverd met behulp van denaturerende gelelektroforese (figuur 2). Drie grootte fracties van cDNA (hoge [H]: 120 tot 200 nt, medium [M]: 85 tot 120 nt en lage [L]: 70-85 nt) teruggevonden, circularized, re-gelineariseerde en PCR-geamplificeerd. PCR-producten van verschillende grootte distributie kan worden waargenomen als gevolg van de verschillende maten van de input fracties. Omdat de PCR-primer introduceert 76 nt aan het cDNA, moeten grootte variëren tussen de 196 tot 276 nt voor hoge, 161-196 nt voor middelgrote en 146-161 nt voor de geringe omvang fracties. PCR-producten afwezig zijn wanneer er geen antilichaam werd gebruikt voor de immunoprecipitatie (lanen 1-3).

Discussion

Sinds de iClip protocol bevat een breed scala van enzymatische reacties en zuivering stappen, is het niet altijd gemakkelijk te identificeren een probleem wanneer een experiment mislukt. Met het oog op controle voor de specificiteit van geïdentificeerde RNA cross-link plaatsen, moeten een of meer negatieve controles worden gehandhaafd gedurende de gehele experiment en de daaropvolgende computationele analyses. Deze controles kunnen de no-antilichaam monster, de niet-cross-linked cellen, of immunoprecipitatie van knockout cellen of weefsel. Idealiter moeten deze controle-experimenten niet zuiveren geen eiwit-RNA-complexen, en daarom moet er geen signaal op de SDS-PAGE gel, en geen waarneembare producten na PCR-amplificatie te geven. High-throughput sequencing van deze controle bibliotheken moeten terugkeren weinig unieke sequenties. Knockdown cellen worden niet aanbevolen als een sequencing controle, omdat de resulterende sequenties nog overeen om cross-link plaatsen van hetzelfde eiwit, dat is gezuiverd van knockdown cellen in kleinere hoeveelheden.

Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting met PCR-producten uit eerdere experimenten te vermijden. De beste manier om dit probleem te minimaliseren is het ruimtelijk scheiden pre-en post-PCR stappen. Idealiter zou de analyse van de PCR-producten en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een aparte ruimte. Bovendien moet elk lid van het laboratorium gebruik maken van hun eigen set van buffers en andere reagentia. Op deze manier kunnen bronnen van besmetting gemakkelijker geïdentificeerd worden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads	Invitrogen	10001D	use protein G for mouse or goat antibody
RNase I	Ambion	AM2295	activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I	New England Biolabs	M0204S
PNK	New England Biolabs	M0201S
proteinase K	Roche Group	03115828001
Superscript III reverse transcriptase	Invitrogen	18080044
Circligase II	Epicentre Biotechnologies	CL9021K
FastDigest® BamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™ SuperMix I	Invitrogen	12342010	this PCR mix gives the best results in our hands