Summary
Denna video protokoll visar hur du diskriminera och räkna bona fide neurala stamceller i en blandad population av neurala föregångare celler genom att använda neurala kolonibildande celler analys.
Abstract
Den neurosphere analys (NSA) är en av de mest använda metoderna för att isolera, expandera och också beräkna frekvensen av neurala stamceller (NSCs). Dessutom har denna serumfritt kultur systemet också använts för att expandera stamceller och bestämma deras frekvens från en rad olika tumörer och normal vävnad. Det har visat sig nyligen att en en-till-ett förhållande inte existerar mellan neurosphere bildning och NSCs. Detta tyder på att NSA som för närvarande tillämpas, överskattar frekvensen av NSCs i en blandad population av neurala föregångare celler som isolerats från både embryonala och vuxna däggdjur hjärna. Denna video praktiskt demonstrerar en roman kollagenbaserade halvfasta analys, neurala-kolonibildande celler analys (N-fiske), som har förmågan att skilja stamceller från stamceller baserat på deras långsiktiga proliferativ potential, och ger därmed en metod att räkna NSC frekvens. I N-fiske, är kolonier ≥ 2 mm i diameter härrör från celler som uppfyller alla funktionella kriterier av en NSC, medan kolonier <2mm härrör från stamceller. N-fiske förfarande kan användas för celler framställs av olika källor, inklusive primära och odlade vuxna eller embryonala CNS musceller. Här använder vi celler som framställts av passagen en neurospheres genererats från embryonala dag 14 möss hjärnan för att utföra N-fiske. Kulturerna fylls med spridning medelhög var sjunde dag i tre veckor så att pläterade cellerna att ställa ut sin fulla proliferativ potential och därefter frekvensen av neurala stamceller och bona fide neurala stamceller beräknas respektive genom att räkna antalet kolonier som är <2 mm och de som är ≥ 2 mm i förhållande till antalet celler som från början var klädd.
Protocol
1. Objekt som behöver förberedas innan du fortsätter till Cell Plating:
- Lämplig volym av hela NSC mediet bereds genom att blanda NeuroCult NSC bassubstratets och NeuroCult NSC spridning Kosttillskott vid ett 9:1-förhållande, respektive.
- Ett delprov av NeuroCult NCFC serumfritt medium utan Cytokiner är tinade.
- Mediet värms upp i ett 37 ° C vattenbad.
- Stamlösningar av epidermal tillväxtfaktor (EGF), grundläggande fibroblastic tillväxtfaktor (B-FGF) vid koncentration av 10 mikrogram / ml och heparin på 0,2% är beredda framåt.
- Beroende på försöket storlek, finns flera 35mm vävnadskultur rätter som behövs för att platta cellerna och ett 150-200cm plast petriskål behövs också för att hålla dubbla 35mm rätter och en tredje 35mm skål för vatten.
2. Cellberedningen:
Beroende på ditt experiment kan celler vara beredd från en vuxen eller embryonala källa (primär dissocierade vävnad eller dissocierade neurospheres). Dissekera vävnader från vuxna / embryonala mus centrala nervsystemet (CNS) eller separera vuxen / embryonala-derived neurospheres som beskrivits tidigare 1,2 och sedan:
- Den enda cellsuspension passerar genom en 40-ìm storlek filternät för att undanröja icke-differentierade klumpar.
- 10μl av cellsuspensionen blandas med 90μl av Trypan blått för att utföra ett celltal. OBS: Andra lämpliga cell spädningar kan också användas.
- Om du använder primära embryonala eller vuxna härrör neurala celler, späd cellsuspension till en koncentration på 6,5 x 10 5 celler / ml i fullständig NSC medium. Om du använder celler från dissocierade neurospheres från vuxna eller embryonala neurala celler, späd cellsuspension till en koncentration på 2,2 x 10 5 celler / ml i fullständig NSC medium.
3. Plätering Celler i Halvfast N-fiske Medium:
- En lämplig volym av följande komponenter blandas i ordning, beroende på antalet replikat. Här kan vi blanda den mängd som behövs för två replikat eller kopiera rätter. För ytterligare antal replikat, se tabell 1.
- 1,7 mL NeuroCult NCFC serumfritt medium utan cytokiner
- 330 mikroliter av NeuroCult NSC spridning Kosttillskott
- 6,6 mikroliter av EGF (10μg/mL)
- 32 mikroliter av Penicillin / streptomycin
- 3,3 mikroliter av B-FGF (10μg/mL) krävs endast om odling celler som härrör från vuxna neurala celler.
- 3,3 mikroliter av heparin (0,2%) krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler.
- 25μL cellsuspension (av 2,2 x 10 5 celler / ml celler från dissocierade neurospheres eller 6,5 x 10 5 celler / ml primära celler från dissocierade CNS vävnad). OBS: Den sista cellen pläterade siffror bör vara ca 2500 celler per 35 mm kulturen maträtt för neurosphere härledda celler och 7500 celler per 35 mm kulturen maträtt för primära celler. I vissa fall har den sista cellen bordläggning densitet justeras genom att utföra ett experiment cell titrering. För statistiska analyser, bör det totala antalet kolonier detekteras efter 21 dagar av kultur vara inom intervallet minst 50 till 150 kolonier.
- Det medium som innehåller cellerna blandas försiktigt och sedan 1,3 ml kall Kollagen lösningen överförs till cellsuspension och blandas väl genom varsam pipettering att inte införa några bubblor.
- Den blandade lösningen lämnas ut till mitten av varje 35mm kultur skålen (~ 1,5 ml / fat) och disken är tippas försiktigt med en cirkelrörelse för att låta blandningen fördelas jämnt över ytan av skålen. .
- Ett duplikat 35 mm kultur rätter placeras i en 100 mm Petri platta. Locket på nya 35 mm maträtt är bort och det öppna fatet är också placeras i samma 100 mm petriskål. Sterilt vatten läggs till i detta öppna 35 mm maträtt att bibehålla optimal fuktighet under inkubationstiden. Square bioassay plattor (245 mm) används när mer replikera 35 mm rätter har inrättats. Återigen, omfattar 2 eller 3 öppna 35 mm rätter som innehåller sterilt vatten.
- Plattorna överförs till en inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet. Den kollagen stelnar genom att öka temperaturen och gelbildningen kommer att ske inom cirka en timme. De kulturer bör inte störas under denna tid.
- Odlade celler inkuberas i 21 dagar (skillnader i kolonin storlek kan klart skiljas efter 21 dagar).
4. Förbereda Påfyllnad Medium och mata kultur:
Som N-fiske kulturerna inkuberas under en längre tid (21 dagar) bör kulturer matas med rätt komplett NeuroCult påfyllning medelstora beredas på nytt enligt följande:
- 4,5 mL NeuroCult NSC bassubstratets blandas med 0,5 mL i NeuroCult NSC spridning Tillägg och sedan tillväxtfaktorer läggas till:
- 250 mikroliter av 10μg/mL fonden (för att ge en slutlig koncentration av 0,5 mikrogram / ml EGF)
- 125 mikroliter av 10μg/mL b-FGF (för att ge en slutlig koncentration av 0.25μg/mL b-FGF) krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler.
- 125 mikroliter på 0,2% Heparin, krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler.
- 60 mikroliter av lämplig kompletta NeuroCult Påfyllnad Medium (för embryonala eller vuxna celler) läggs in i mitten av varje NCFC analys maträtt en gång per 7 dagar under hela NCFC analys kultur inkubation (21 dagar).
5. Scoring N-CFC-analys Derived kolonierna och beräkna frekvensen av bona fide NSCs och neurala progenitorceller:
- Varje 35 mm kulturen skålen är placerad på en inrutade poäng rätt med nätet storlek på 2,0 mm x 2,0 mm och sedan båda skålarna är placerade på mikroskop scenen.
- Med låg effekt (2,5 X - 5X) objektiv, varje rätt skannas och kolonierna poängsätts utifrån deras storlek.
- Kolonier indelas i två huvudkategorier:
- Mindre än 2 mm i diameter
- ≥ 2 mm i diameter
6. Representativa resultat:
Som i neurosphere analys, celler klädd i N-CFC-analysen börja föröka sig och göra små kolonier av celler inom 3 - 7 dagar efter bordläggning (figur 1). Om två veckor, kan kolonier av olika storlekar urskiljas. Medan majoriteten av kolonierna tenderar att sluta växa efter 14 dagar, några kolonier fortsätter att öka i storlek. På dagen 21, kan kolonier delas in i ett av de fyra kategorier: 1) mindre än 0,5 mm i diameter, 2) 0,5 - 1 mm diameter, 3) 1 - 2 mm diameter och 4) ≥ 2 mm i diameter. I praktiken är kolonier mindre än 2 mm i diameter kallas stamceller härstammar (Figur 2) och kolonier ≥ 2 mm i diameter kallas för NSC härrör (Figur 3). Antalet kolonier ≥ 2 mm i diameter per total celler pläterade, representerar frekvensen av den faktiska bona fide neurala stamceller med långsiktiga självförnyelse och flera potentiella kapacitet. Den totala neurosphere bildar frekvens i en viss cell population efter 7-8 dygn i en parallell NSA experiment har uppskattats att likna den totala kolonibildande frekvensen av samma cell population efter 21 dagar i en N-fiske experiment. N-fiske men ger en mer tillåtande skick så att varje cell kan visa sin fulla proliferativ potential.
| Komponent | 2 replikat | 3 replikat | 4 replikat |
| NeuroCult NCFC serumfritt medium utan cytokiner | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC spridning Kosttillskott | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 mikrogram / ml) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| bFGF (10 mikrogram / ml), endast för vuxna celler | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Heparin-lösning (0,2%), endast för vuxna celler | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Penicillin / streptomycin (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Celler på: 2,2 x 10 5 odlade celler / ml eller 6,5 x 10 5 primära celler / ml | 25 | 37,5 | 50 |
| Kollagen Lösning | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabell 1. Komponenter av kompletta N-CFC analys kultur.
Figur 1. Representant kolonier i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 7 dagar efter plätering. Kolonierna kan visa olika morfologi och storlek. Original förstoring, 4x
Figur 2. Representant föregångare härrör kolonier av olika storlekar i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 21 dagar efter plätering. Som framgår, kolonierna har olika morfologi men alla är mindre 2 mm i storlek. Original förstoring, 4x
Figur 3. Representant bona fide stamceller härstammar koloni i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 21 dagar efter plätering. Stamceller härstammar kolonier kan visa olika morfologi (sevideon) men alla är ≥ 2 mm i diameter. Original förstoring, 4x
Discussion
Även neurosphere analys 3,1,2 är den vanligaste metoden att isolera och bygga neurala stamceller från olika källor som adulta och embryonala CNS-vävnad, kan den inte mäta exakt NSC frekvens i en blandad population av neurala föregångare celler (stamceller och stamfäder) eftersom det inte finns ett ett-till ett-förhållande mellan antalet neurospheres och antalet bona fide stamceller 4. För att lösa denna begränsning, har den ursprungliga NSA anpassats så att de neurala stamceller och stamceller att växa till sin fulla spridning kapacitet för tre veckor 5-7. Till skillnad från vätskan NSA, i N-CFCA kolonierna faktiskt kloner härledas, som halvfasta kollagenmatrisen förhindrar migration av enskilda celler pläterade och aggregering av kolonier. För konsekventa resultat med denna analys rekommenderar vi:
- Att säkerställa en inre cellsuspensionen i den ursprungliga cellsuspension. Pass din enda cellsuspension genom ett 40-ìm storlek filternät för att undanröja icke-differentierade klumpar.
- Håll kollagen lösningen på is eller i +4 ° C kylskåp. Kollagen är det sista objektet som ska läggas till blandningen cellsuspension som stelnar genom att öka temperaturen.
- Glöm inte att mata kulturen varje vecka. Lägga till påfyllning medium som innehåller tillväxtfaktor (s) en gång var 7 dagar gör att celler fortsätter att föröka sig under den förlängda kulturen period.
- Den sista cellen plätering densitet har optimerats för celler som härrör från antingen primära eller odlade neurala celler så att det totala antalet kolonier detekteras efter 21 dagar av kultur i NCFC-A är inom intervallet minst 50 till 200 kolonier. Denna serie tillåter detektion av de sällsynta härrör NSC kolonier> 2 mm i diameter i prover samtidigt som tillräckligt antal kolonier för statistiska analyser. Beroende på vilket cellen källa, betydligt färre (<50) och högre antal kolonier (> 250) är ibland erhållas. För få kolonier kommer att resultera i kolonierna> 2 mm i diameter är under bevakningsnivåer, medan alltför många kolonier kommer att resultera i trångboddhet anddepletion av komponenter odlingsmedium resulterar i ett felaktigt koloni räkna. Därför cellen plätering densitet kommer att behöva anpassas därefter (dvs. att öka eller minska det totala antalet celler pläterade)
Disclosures
En av författarna, Sharon A. Louis, är knuten StemCell Technologies Inc, en tillverkare av vissa reagens som används i denna studie.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
