Summary
Deze video protocol laat zien hoe om te discrimineren en te goeder trouw neurale stamcellen te sommen in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen met behulp van de neurale kolonievormende cell assay.
Abstract
De neurosphere assay (NSA) is een van de meest gebruikte methoden om te isoleren, uit te breiden en ook het berekenen van de frequentie van de neurale stamcellen (NSC). Bovendien heeft dit serum-vrije cultuur-systeem ook gebruikt om stamcellen uit te breiden en hun frequentie te bepalen van een verscheidenheid van tumoren en normale weefsels. Het is onlangs aangetoond dat een een-op-een relatie bestaat niet tussen de neurosphere vorming en NSC. Dit suggereert dat de NSA als momenteel wordt toegepast, de frequentie van de NSCs overschat in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen geïsoleerd uit zowel de embryonale en volwassen hersenen van zoogdieren. Deze video praktisch een nieuw collageen op basis van semi-solid test aantoont, is de neurale-kolonie de vorming van cel-assay (N-CBVC), die de mogelijkheid om voort te onderscheiden van progenitor cellen op basis van hun lange termijn proliferatieve potentieel heeft, en dus zorgt voor een methode om op te noemen NSC frequentie. In de N-CBVC, zijn kolonies ≥ 2 mm in diameter afgeleid uit cellen die alle functionele criteria van een NSC te voldoen, terwijl de kolonies <2mm zijn afgeleid van voorouders. De N-CBVC procedure kan worden gebruikt voor de cellen bereid uit verschillende bronnen, waaronder het basis-en gekweekte volwassen of embryonale muis CZS-cellen. Hier gebruiken we cellen bereid uit een passage neurospheres gegenereerd op basis van embryonale dag 14 muizen hersenen om N-CBVC uit te voeren. De culturen zijn aangevuld met proliferatie medium om de zeven dagen voor drie weken, zodat de verguld cellen om hun volledige potentieel proliferatieve vertonen en vervolgens de frequentie van de neurale progenitor en bonafide neurale stamcellen wordt respectievelijk berekend door het tellen van het aantal kolonies die <2mm en degenen die ≥ 2 mm in de hand van het aantal cellen die aanvankelijk werden uitgeplaat.
Protocol
1. Artikelen die moeten worden voorbereid voordat doorgaat to Cell Plating:
- Geschikt volume van complete NSC medium wordt bereid door het mengen van NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen op een 09:01 verhouding, respectievelijk.
- Een deel van het NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines is ontdooid.
- Het medium wordt opgewarmd in een 37 ° C waterbad.
- Stock oplossingen van epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblastische groeifactor (b-FGF), bij een concentratie van 10 ug / ml en heparine op 0,2% vooruit zijn voorbereid.
- Afhankelijk van de grootte van experiment, zijn verschillende 35mm weefselkweek gerechten die nodig zijn om het bord van de cellen en een 150-200cm plastic petrischaal is ook nodig om de dubbele 35mm gerechten te houden en een derde 35mm schotel voor water.
2. Cel Bereiding:
Afhankelijk van uw experiment, kunnen cellen worden bereid uit een volwassene of embryonale bron (primaire gedissocieerde weefsel of gedissocieerd neurospheres). Ontleden weefsels van volwassen / embryonale muis centraal zenuwstelsel (CZS) of distantiëren volwassenen / embryonale-afgeleide neurospheres zoals eerder beschreven 1,2 en vervolgens:
- De enkele celsuspensie wordt door een 40-um-size mesh filter om zo niet-gesplitste klonten te verwijderen.
- 10μl van de celsuspensie wordt gemengd met 90μl van trypan blauw om een celgetal uit te voeren. Opmerking: Andere juiste cel verdunningen kunnen ook worden gebruikt.
- Bij gebruik van primaire embryonale of adulte afgeleide neurale cellen, verdunnen de celsuspensie om een concentratie van 6,5 x 10 5 cellen / ml in volledig NSC medium. Bij het gebruik van cellen van los neurospheres afgeleid van volwassen of embryonale neurale cellen, verdunnen de celsuspensie om een concentratie van 2,2 x 10 5 cellen / ml in volledig NSC medium.
3. Plating Cellen in Semi-solid N-CFCA Medium:
- Het juiste volume van de volgende componenten wordt gemengd in orde is, afhankelijk van het aantal herhalingen. Hier hebben we mengen het bedrag dat nodig is voor twee replicaten of dupliceren gerechten. Voor extra nummers van herhalingen, zie tabel 1.
- 1,7 ml NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines
- 330 pi van NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen
- 6,6 pi van de EGF (10μg/mL)
- 32 pl van penicilline / streptomycine
- 3,3 pi van b-FGF (10μg/mL) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen.
- 3,3 pi van heparine (0,2%) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen.
- 25μL celsuspensie (van 2,2 x 10 5 cellen / ml cellen van gedissocieerd neurospheres of 6,5 x 10 5 cellen / ml primaire cellen van gedissocieerd CNS weefsel). Opmerking: De laatste vergulde aantal cellen moet ongeveer 2500 cellen per 35 mm cultuur schotel voor neurosphere afgeleide cellen en 7500 cellen per 35 mm cultuur schotel voor primaire cellen. In sommige gevallen, de laatste cel plating dichtheid moet worden aangepast door het uitvoeren van een cel titratie experiment. Voor statistische analyses, moet het totale aantal gedetecteerde kolonies na 21 dagen van de cultuur binnen het bereik van ten minste 50 tot 150 kolonies.
- Het medium dat de cellen is matig en vervolgens gemengd 1,3 ml koud Collageen oplossing is overgebracht naar de cel schorsing en goed gemengd met zachte pipetteren te voorkomen dat er eventuele luchtbellen.
- De gemengde oplossing is afgegeven voor het midden van elk 35mm cultuur schaal (~ 1,5 ml / gerecht) en de gerechten worden getipt zachtjes met een draaiende beweging te laten het mengsel verspreid gelijkmatig over het oppervlak van de schotel. .
- De dubbele 35 mm cultuur gerechten worden geplaatst in een 100 mm Petri plaat. Het deksel van de nieuwe 35 mm gerecht is verwijderd en de open schotel is ook geplaatst in dezelfde 100 mm petrischaal. Steriel water wordt toegevoegd aan deze open 35 mm schaal om een optimale vochtigheidsgraad te behouden tijdens de incubatieperiode. Bioassay vierkante platen (245 mm) worden gebruikt wanneer meer repliceren 35 mm gerechten zijn opgezet. Nogmaals, onder 2 of 3 open 35 mm platen met steriel water.
- De platen worden overgebracht naar een incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. Het collageen stolt door het verhogen van de temperatuur en gelvorming zal plaatsvinden binnen ongeveer een uur. De culturen moeten niet gestoord worden tijdens deze periode.
- Gekweekte cellen worden geïncubeerd gedurende 21 dagen (verschillen in kolonie grootte kunnen duidelijk onderscheiden worden na 21 dagen).
4. Voorbereiden Replenishment Medium en voeden van de cultuur:
Als N-CBVC culturen worden geïncubeerd voor een langere periode (21 dagen), moet culturen worden gevoed met de juiste volledige NeuroCult replenishment medium vers bereid als volgt:
- 4,5 ml NeuroCult NSC basismedium wordt gemengd met 0,5 mL van NeuroCult NSC Proliferatie Aanvullingen en dan de groeifactoren wordt toegevoegd:
- 250 ul van 10μg/mL EGF (tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 ug / ml EGF geven)
- 125 ul van 10μg/mL b-FGF (tot een uiteindelijke concentratie van 0.25μg/mL b-FGF geven) alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen.
- 125 pl van 0,2% heparine, alleen vereist als het kweken van cellen afkomstig van volwassen neurale cellen.
- 60 pi van de juiste volledige NeuroCult Replenishment Medium (voor embryonale of volwassen cellen) wordt toegevoegd aan het midden van elk NCFC Assay gerecht eens in de 7 dagen tijdens de gehele NCFC Assay cultuur incubatie (21 dagen).
5. Scoring N-CFK Assay afgeleide Koloniën en berekening van de frequentie van bonafide NSCs en neurale progenitorcellen:
- Elke 35 mm cultuur schotel is geplaatst op een gerasterde scoren schotel met het rooster afmeting van 2,0 mm x 2,0 mm en vervolgens beide gerechten worden geplaatst op de microscoop podium.
- Het gebruik van laag vermogen (2,5 maal - 5X) objectief, elk gerecht wordt gescand en de kolonies worden gescoord op basis van hun grootte.
- Kolonies zijn ingedeeld in twee grote categorieën:
- Minder dan 2 mm diameter
- ≥ 2 mm diameter
6. Representatieve resultaten:
Net als in neurosphere assay, cellen uitgeplaat in N-CFC-test start te laten groeien en maken kleine kolonies van cellen binnen 3 - 7 dagen na beplating (figuur 1). In twee weken tijd, kunnen kolonies van verschillende afmetingen worden onderscheiden. Terwijl de meerderheid van de kolonies hebben de neiging om te stoppen met groeien na 14 dagen, sommige kolonies blijven toenemen in omvang. Op dag 21, kan kolonies worden ingedeeld in een van de vier categorieën: 1) minder dan 0,5 mm diameter, 2) 0,5 - 1 mm diameter, 3) 1 - 2 mm diameter en 4) ≥ 2 mm in diameter. In de praktijk zijn kolonies kleiner dan 2 mm diameter aangeduid als progenitor afgeleid (figuur 2) en kolonies ≥ 2 mm in diameter worden aangeduid als NSC afgeleid (figuur 3). Het aantal kolonies ≥ 2 mm in diameter per totaal cellen uitgeplaat, vertegenwoordigt de frequentie van de werkelijke bonafide neurale stamcellen met de lange termijn zelf-vernieuwing en multi-potentiële mogelijkheden. De totale neurosphere de vorming van frequentie in een bepaalde cel populatie na 7-8 dagen in een parallel experiment NSA is geschat op ongeveer gelijk zijn aan de totale kolonievormende frequentie van de dezelfde cel bevolking na 21 dagen in een N-CFCA experiment. De N-CBVC echter, geeft een meer tolerante voorwaarde om zo elke cel kan zijn volledige proliferatieve potentieel te tonen.
| Bestanddeel | 2 repliceert | 3 repliceert | 4 repliceert |
| NeuroCult NCFC serum-vrij medium zonder Cytokines | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC Proliferatie Supplementen | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 ug / ml) | 6.6 | 9.9 | 13,2 |
| bFGF (10 ug / ml), alleen voor volwassen cellen | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| Heparine-oplossing (0,2%), alleen voor volwassen cellen | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| Penicilline / streptomycine (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Cellen op: 2,2 x 10 5 gekweekte cellen / ml of 6,5 x 10 5 primaire cellen / ml | 25 | 37,5 | 50 |
| Collageen Solution | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabel 1. Componenten van volledige N-CFK assay cultuur.
Figuur 1. Vertegenwoordiger kolonies in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 7 dagen na plating. De kolonies kunnen een verschillend morfologie en grootte. Originele vergroting; 4x
Figuur 2. Vertegenwoordiger stamvader afgeleid kolonies van verschillende grootte in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 21 dagen na plating. Zoals te zien is, de kolonies hebben verschillende morfologie, maar allemaal zijn minder 2 mm groot. Originele vergroting; 4x
Figuur 3. Vertegenwoordiger van bona fide stamcellen afgeleid kolonie in N-CBVC cultuur van de passage een E14 muis NSCs 21 dagen na plating. Stamcellen afgeleid kolonies kunnen tonen verschillende morfologie (ziede video), maar alle zijn ≥ 2 mm in diameter. Originele vergroting; 4x
Discussion
Hoewel neurosphere test 3,1,2 is de meest voorkomende methode om te isoleren en neurale stamcellen uit te breiden van een verscheidenheid van bronnen, zoals volwassen en embryonale CZS weefsel, het kan niet nauwkeurig de NSC frequentie te meten in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen (stam en voorlopers) als er niet een een op een relatie tussen het aantal neurospheres en het aantal bonafide stamcellen 4. Om deze beperking, heeft de oorspronkelijke NSA zo aangepast om de neurale stam en voorouders om hun volledige verspreiding capaciteit groeien gedurende drie weken 5-7. In tegenstelling tot de vloeistof NSA, in de N-CBVC de kolonies zijn eigenlijk klonaal afgeleid, zoals de semi-vaste collageen matrix voorkomt migratie van de afzonderlijke cellen geplateerd en aggregatie van de kolonies. Voor consistente resultaten met deze test raden wij aan:
- Zorg voor een enkele cel suspensie in de originele celsuspensie. Pass je enkele celsuspensie door middel van een 40-um-size mesh filter om zo niet-gesplitste klonten te verwijderen.
- Houd de collageen-oplossing op ijs of in de +4 ° C koelkast. Collageen is het laatste item dat moet worden toegevoegd aan het mengsel van celsuspensie als het stolt door het verhogen van de temperatuur.
- Vergeet niet om de cultuur voeden elke week. Het toevoegen van de replenishment medium dat de groei factor (en) eens in de zeven dagen zal cellen blijven woekeren op de verlengde periode van cultuur.
- De laatste cel beplating dichtheid zijn geoptimaliseerd voor de cellen, afkomstig van zowel de primaire of gekweekte neurale cellen, zodat het totale aantal gedetecteerde kolonies na 21 dagen van cultuur in de NCFC-A is binnen het bereik van ten minste 50 tot 200 kolonies. Deze serie maakt de ontdekking van de zeldzame NSC afgeleid kolonies> 2mm in diameter in de monsters terwijl voldoende aantallen kolonies voor statistische analyses. Afhankelijk van de start cel bron, significant minder (<50) en hogere aantallen kolonies (> 250) zijn soms verkregen. Te weinig kolonies zal resulteren in de koloniën> 2mm in diameter zijn beneden de detectielimiet niveaus, terwijl te veel kolonies zal resulteren in overbevolking anddepletion van groeimedium componenten wat resulteert in een onnauwkeurige kolonie te tellen. Daarom cel-plating dichtheid zal moeten dienovereenkomstig worden aangepast (dat wil zeggen verhogen of verlagen van het totale aantal cellen uitgeplaat)
Disclosures
Een van de auteurs, Sharon A. Louis, is aangesloten bij StemCell Technologies Inc, een producent van een aantal reagentia die in deze studie.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
