Summary
זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.
Abstract
Assay neurosphere (NSA) הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר בשימוש על מנת לבודד, להתרחב גם לחשב את תדירות בתאי גזע עצביים (NSCs). יתר על כן, מערכת זו סרום ללא תרבות יש גם המועסקים להרחיב בתאי גזע לקבוע תדר שלהם מתוך מגוון של גידולים רקמות נורמליות. הוכח לאחרונה כי מערכת יחסים אחד על אחד אינו קיים בין היווצרות NSCs neurosphere. הדבר מצביע על כך NSA כמו המוחל כעת, מגזים בהערכת התדירות של NSCs באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר מבודד מהמוח שניהם יונקים עובריים מבוגרים. סרט הווידאו הזה מדגים למעשה קולגן הרומן מבוסס מוצקים למחצה assay, העצבית, המושבה להרכיב assay תא (N-CFCA), אשר יש לו את היכולת להבחין נובעת ובתאים מבוסס על הפוטנציאל שלהם לטווח ארוך שגשוג, ובכך מספק שיטה למנות את תדירות המל"ל. בשנות ה N-CFCA, מושבות ≥ 2 מ"מ קוטר נגזרות תאים העונים על כל הקריטריונים תפקודית של המועצה לביטחון לאומי, ואילו מושבות <2mm נגזרות אבות. ההליך N-CFCA ניתן להשתמש בתאים מוכנים ממקורות שונים כולל בוגרים הראשי בתרבית תאים במערכת העצבים המרכזית או עובריים בעכבר. כאן אנו משתמשים בתאי מכינים את הקטע neurospheres שנוצר מיום 14 עובריים במוח העכברים לבצע N-CFCA. תרבויות הם מתחדש עם התפשטות בינונית כל שבעה ימים במשך שלושה שבועות על מנת לאפשר את התאים מצופה להפגין פוטנציאל שגשוג מלא שלהם ולאחר מכן התדירות של אבי עצביים בתום בתאי גזע עצביים בתום מחושב בהתאמה על ידי ספירת מספר מושבות כי הם <2mm ואלה הם ≥ 2mm התייחסות למספר תאים שהיו מצופה בתחילה.
Protocol
1. הפריטים צריכים להיות מוכנים לפני שתמשיך ציפוי נייד:
- נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה.
- Aliquot של בינונית NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים הינו מופשר.
- המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- פתרונות במלאי של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), הצמיחה הבסיסית גורם fibroblastic (ב-FGF) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ו - הפרין ב -0.2% מוכנים מראש.
- בהתאם לגודל הניסוי, מספר 35mm תרבות מנות רקמה יש צורך בתאים צלחת אחת 150-200cm פלסטיק צלחת פטרי נחוץ גם כדי להחזיק את הכלים 35mm כפולות צלחת 35mm שלישי מים.
2. תא הכנה:
בהתאם הניסוי שלך, תאים יכולים להיות מוכנים ממקור מבוגר או עובריים (רקמה ניתק ראשוני או neurospheres ניתק). לנתח רקמות מן הבוגרים / עכבר עובריים במערכת העצבים המרכזית (CNS) או לנתק neurospheres מבוגר / עובריים שמקורם כפי שתואר לפני 1,2 ואז:
- השעיית תא בודד עובר דרך פילטר של 40 מיקרומטר בגודל רשת כדי להסיר אי - ניתק גושים.
- 10μl ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90μl של Trypan כחול לבצע ספירת תאים. הערה: דילולים אחרים בתא המתאים יכול לשמש גם.
- אם אתה משתמש עובריים ראשוני או מבוגר תאים עצביים שמקורם, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 6.5 x 10 5 תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים. אם באמצעות תאים neurospheres ניתק נגזר תאים עצביים למבוגרים או עובריים, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 2.2 x 10 5 תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים.
3. ציפוי תאים בינוני N-CFCA חצי מוצק:
- הכרך המתאים את הרכיבים הבאים מעורבת כדי, תלוי במספר משכפל. כאן אנו לערבב את הסכום הדרוש עבור שני משכפל או לשכפל הכלים. עבור מספרים נוספים של משכפל, עיין בטבלה 1.
- 1.7 מ"ל של מדיום NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים
- 330 μL של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק גרעיני
- 6.6 μL של EGF (10μg/mL)
- 32 μL של פניצילין / סטרפטומיצין
- 3.3 μL של b-FGF (10μg/mL) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים.
- 3.3 μL של הפרין (0.2%) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים.
- 25μL ההשעיה תאים (של 2.2 x 10 5 תאים / מ"ל תאים מן neurospheres ניתק או 6.5 x 10 5 תאים / מ"ל תאים ראשוניים מרקמת ניתק CNS). הערה: המספרים התא מצופה הסופי צריך להיות בערך 2500 תאים לכל צלחת 35 מ"מ תרבות עבור תאים שמקורם neurosphere ו 7500 תאים לכל צלחת 35 מ"מ עבור התרבות תאים ראשוניים. במקרים מסוימים, את הצפיפות הסופית ציפוי התא חייב להיות מותאם על ידי ביצוע ניסוי טיטרציה התא. עבור ניתוחים סטטיסטיים, המספר הכולל של מושבות שזוהו לאחר 21 ימים של תרבות צריכה להיות בטווח של לפחות 50-150 מושבות.
- המדיום המכיל את התאים מעורבת בעדינות ולאחר מכן 1.3 מ"ל של תמיסת קולגן קר מועבר ההשעיה התא ומעורבים היטב על ידי pipetting עדין כדי למנוע החדרת כל הבועות.
- הפתרון הוא לוותר מעורבת למרכז של כל מנה תרבות 35mm (~ 1.5 mL / תבשיל) וכן את הכלים הם היטה בעדינות בתנועות מעגליות לתת לתערובת להתפשט באופן שווה על פני השטח של המנה. .
- לשכפל 35 מ"מ תרבות מנות ממוקמות לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. המכסה של מאכל חדש 35 מ"מ הוא להסיר את המנה לפתוח ממוקמת גם את צלחת פטרי 100 מ"מ אותו. מים סטריליים מתווסף צלחת זה 35 מ"מ פתוח כדי לשמור על לחות אופטימלית במהלך תקופת הדגירה. צלחות המבדק סקוור (245 מ"מ) משמשים כאשר לשכפל עוד 35 מנות מ"מ הוקמו. שוב, כולל 2 או 3 מנות פתוח 35 מ"מ המכיל מים סטריליים.
- הלוחות מועברים להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו 95% לחות. נקרש קולגן על ידי הגדלת הטמפרטורה היווצרות קריש תתרחש בתוך כשעה. תרבויות לא צריך להיות מופרע בתקופה זו.
- תאים בתרבית מודגרת במשך 21 ימים (הבדלים בגודל המושבה ניתן להבחין בבירור לאחר 21 ימים).
4. הכנת בינוני רענון והאכלת תרבות:
כמו N-CFCA תרבויות מודגרת לתקופה ממושכת של זמן (21 ימים), תרבויות צריך להיות מוזן עם NeuroCult המלא הולם בינוני חידוש מוכן טרי כדלקמן:
- 4.5 מ"ל של מדיום NSC NeuroCult בסל הוא מעורבב עם 0.5 מ 'L של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק ולאחר מכן את גורמי גדילה הוא הוסיף:
- 250 μL של 10μg/mL EGF (לתת הריכוז הסופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל EGF)
- 125 μL של 10μg/mL ב-FGF (לתת הריכוז הסופי של 0.25μg/mL ב-FGF) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים.
- 125 μL של הפרין 0.2%, נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים.
- 60 μL של NeuroCult בינונית המתאימה להשלים רענון (עבור תאים עובריים או מבוגר) יתווסף למרכז של כל מנה Assay NCFC פעם 7 ימים במהלך הדגירה Assay כולו NCFC תרבות (21 ימים).
5. ניקוד N-CFC המושבות Assay נגזר חישוב תדירות NSCs בתום לב ועל ובתאים עצבית:
- 35 כל תרבות צלחת מ"מ מונח על צלחת הבקיע gridded עם גודל רשת של 2.0 מ"מ x 2.0 מ"מ ואז הן המנות מונחות על הבמה מיקרוסקופ.
- באמצעות צריכת חשמל נמוכה (2.5x - 5X) המטרה העדשה, כל מנה נסרק המושבות הם הבקיע מבוסס על הגדלים שלהם.
- מושבות מסווגים לשתי קטגוריות עיקריות:
- פחות מ 2 מ"מ קוטר
- ≥ 2 מ"מ קוטר
6. נציג תוצאות:
כמו assay neurosphere, תאים מצופה ב assay N-CFC להתחיל להתרבות ולגרום מושבות קטנות של תאים בתוך 3 - 7 ימים לאחר ציפוי (איור 1). בעוד שבועיים, מושבות בגדלים שונים ניתן להבחין. בעוד מרבית מושבות נוטים להפסיק לגדול לאחר 14 ימים, כמה מושבות להמשיך להגדיל את שטחו. ביום 21, מושבות ניתן לסווג לאחת מארבע קטגוריות: 1) פחות מ -0.5 מ"מ קוטר, 2) 0.5-1 מ"מ קוטר, 3) 1-2 מ"מ קוטר 4) ≥ 2 מ"מ בקוטר. למעשה, מושבות קטן יותר מאשר קוטר 2 מ"מ מכונים אבי נגזרת (איור 2) ומושבות ≥ 2 מ"מ בקוטר מכונים המל"ל נגזרת (איור 3). מספר מושבות ≥ 2 מ"מ בקוטר לכל התאים הכולל מצופה, מייצג את התדירות של התאים בפועל בתום לב גזע עצביים עם התחדשות עצמית לטווח ארוך ורב פוטנציאל היכולות. Neurosphere הכולל הקמת תדר באוכלוסייה תא מסוים אחרי יום 7-8 בניסוי NSA במקביל הוערך להיות דומה המושבה הכולל הקמת תדר של האוכלוסייה באותו התא לאחר 21 ימים בניסוי N-CFCA. N-CFCA לעומת זאת, מספק תנאי מתירני יותר כמו כל תא יכול להראות פוטנציאל שגשוג המלא.
| רכיב | 2 משכפל | 3 משכפל | 4 משכפל |
| NeuroCult NCFC סרום ללא בינוני ללא ציטוקינים | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC הפצת תוספי | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 מיקרוגרם / מ"ל) | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| bFGF (10 מיקרוגרם / מ"ל), רק תאים בוגרים | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| הפתרון הפרין (0.2%), רק תאים בוגרים | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| פניצילין / סטרפטומיצין (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| תאים ב: 2.2 x 10 5 תאים בתרבית / mL או 6.5 x 10 5 תאים ראשוניים / mL | 25 | 37.5 | 50 |
| קולגן פתרון | 1300 | 1950 | 2600 |
טבלה 1. רכיבים של התרבות N-CFC להשלים assay.
באיור 1. מושבות נציג בתרבות N-CFCA אחד E14 NSCs מעבר העכבר 7 ימים לאחר ציפוי. מושבות עשוי להציג מורפולוגיה גודל שונים. הגדלה מקורי; 4x
איור 2. מושבות אבי נציג נגזר בגדלים שונים בתרבות N-CFCA בקטע אחד של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. כפי שניתן לראות, מושבות יש מורפולוגיה שונה אבל כל 2 מ"מ פחות בגודל. הגדלה מקורי; 4x
איור 3. Bona נציג תא גזע בתום נגזר המושבה בתרבות N-CFCA את הקטע של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. תא גזע שמקורם מושבות עשוי להציג מורפולוגיה שונה (ראהאת הוידאו) אך כולם ≥ 2 מ"מ בקוטר. הגדלה מקורי; 4x
Discussion
למרות assay neurosphere 3,1,2 היא השיטה הנפוצה ביותר לבודד להרחיב בתאי גזע עצביים ממגוון רחב של מקורות כמו רקמת מערכת העצבים המרכזית מבוגרים עובריים, לא ניתן למדוד במדויק את תדירות NSC באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר (גזע אבות) כאשר אין מערכת יחסים 12:59 בין מספר neurospheres ומספר בתום בתאי גזע בתום 4. כדי לענות על מגבלה זו, NSA המקורי הותאם כדי לאפשר את גזע עצביים ואת אבות לגדול יכולת התפשטות המלא שלהם במשך שלושה שבועות 5-7. בניגוד NSA נוזלי, ב N-CFCA המושבות הם למעשה נגזרת clonally, כמו מטריקס חצי מוצק קולגן ומונע הגירה של תאים בודדים מצופה צבירה של המושבות. לקבלת תוצאות עקביות עם assay זה אנו ממליצים:
- ודא השעיה תא יחיד ההשעיה התא המקורי. Pass ההשעיה תא בודד שלך דרך פילטר של 40 מיקרומטר בגודל רשת כדי להסיר אי - ניתק גושים.
- שמור את הפתרון קולגן על הקרח או את המקרר 4 מעלות צלזיוס. קולגן הוא הפריט האחרון שיש להוסיף לתערובת של השעיה התא כפי שהוא נקרש על ידי הגדלת הטמפרטורה.
- אל תשכח להאכיל את התרבות בכל שבוע. הוספת בינוני חידוש המכיל גורם הגדילה (ים) פעם 7 ימים יאפשר התאים ממשיכים להתרבות במשך תקופה תרבות המורחבת.
- צפיפות הסופי ציפוי תא מוטבו עבור תאים שמקורם או תאים עצביים ראשוני או תרבותי, כך שהמספר הכולל של מושבות זוהה לאחר 21 ימים של התרבות ב-NCFC נמצא בטווח של לפחות 50-200 מושבות. מגוון זה מאפשר איתור של הנדיר NSC מושבות נגזר> 2mm בקוטר בדגימות תוך מתן בכמות מספקת של מושבות עבור ניתוחים סטטיסטיים. בהתאם למקור תא ההתחלה, משמעותית פחות (<50) וכן מספרים גבוהים יותר של מושבות (> 250) מתקבלים לפעמים. מושבות מעט מדי תגרום המושבות> 2mm בקוטר להיות מתחת לרמות זיהוי, ואילו מושבות רבות מדי תגרום anddepletion הצפיפות של המדיום מרכיבי הצמיחה וכתוצאה מכך ספירת המושבה מדויק. לכן צפיפות ציפוי התא צריך להיות בהתאם (כלומר להגדיל או להקטין את המספר הכולל של תאים מצופה)
Disclosures
אחד מחברי, שרון א 'לואיס, המזוהה עם StemCell Technologies Inc, יצרנית של כמה חומרים כימיים המשמשים במחקר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
