Summary
यह वीडियो प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे भेदभाव और तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के तंत्रिका कोशिका परख कॉलोनी के गठन का उपयोग कर एक मिश्रित आबादी में सदाशयी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एन्यूमरेट.
Abstract
neurosphere परख (एनएसए) सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों को अलग करने, विस्तार और भी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) की आवृत्ति की गणना की है. इसके अलावा, इस सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली भी करने के लिए स्टेम सेल का विस्तार करने के लिए और ट्यूमर और सामान्य ऊतकों की एक किस्म से अपने आवृत्ति निर्धारित नियोजित किया गया. यह हाल ही में दिखाया गया है कि एक रिश्ता एक एक neurosphere गठन और एनएससी के बीच मौजूद नहीं है. यह पता चलता है कि एनएसए के रूप में वर्तमान में लागू है, दोनों भ्रूण और वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क से अलग तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में एनएससी की आवृत्ति overestimates. यह वीडियो व्यावहारिक रूप से एक उपन्यास अर्द्ध ठोस परख आधारित कोलेजन को दर्शाता है, तंत्रिका कॉलोनी सेल (एन CFCA) परख, जो पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से स्टेम उनके दीर्घकालिक proliferative संभावित आधार पर भेदभाव करने की क्षमता है, और इस प्रकार निर्मित करना प्रदान करता है एक विधि एनएससी आवृत्ति एन्यूमरेट करने के लिए. एन CFCA ≥ 2 मिमी व्यास में कालोनियों कोशिकाओं है कि एक एनएससी के सभी कार्यात्मक मानदंडों को पूरा से निकाली गई है, जबकि कालोनियों <2mm progenitors से निकाली गई है. एन - CFCA प्रक्रिया प्राथमिक और सुसंस्कृत वयस्क या भ्रूण माउस सीएनएस कोशिकाओं सहित विभिन्न स्रोतों से तैयार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम बीतने से एक भ्रूण दिन 14 चूहों के मस्तिष्क से उत्पन्न एन CFCA प्रदर्शन neurospheres तैयार कोशिकाओं का उपयोग करें. संस्कृतियों के प्रसार के माध्यम से तीन सप्ताह के लिए हर सात दिन मंगाया मढ़वाया कोशिकाओं को अपनी पूर्ण proliferative संभावित प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं और फिर तंत्रिका पूर्वज और सदाशयी तंत्रिका स्टेम सेल की आवृत्ति क्रमशः कालोनियों कि <2mm हैं की संख्या की गणना के द्वारा की गणना है और हैं कि कोशिकाओं की संख्या है कि शुरू में मढ़वाया थे के संदर्भ में ≥ 2mm हैं.
Protocol
1. आइटम है कि सेल चढ़ाना के लिए कार्यवाही करने से पहले तैयार रहो करने की आवश्यकता:
- पूरा एनएससी मध्यम की उपयुक्त मात्रा 09:01 के अनुपात में NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम और NeuroCult एनएससी प्रसार पूरक मिश्रण, क्रमशः द्वारा तैयार की है.
- साइटोकिन्स बिना NeuroCult NCFC सीरम मुक्त मध्यम के एक विभाज्य thawed है.
- मध्यम एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म है.
- Epidermal वृद्धि कारक (EGF), 10 μg / एमएल और 0.2% पर हेपरिन की एकाग्रता में बुनियादी fibroblastic वृद्धि कारक (ख FGF) के शेयर समाधान आगे तैयार हैं.
- प्रयोग के आकार पर निर्भर करता है, कई 35 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन प्लेट कोशिकाओं और एक 150-200cm प्लास्टिक पेट्री डिश भी डुप्लिकेट 35 मिमी व्यंजन पकड़ की जरूरत है और पानी के लिए एक तिहाई 35 मिमी पकवान की जरूरत है.
2. सेल तैयार:
अपने प्रयोग के आधार पर, कोशिकाओं को एक वयस्क या भ्रूण स्रोत (प्राथमिक dissociated ऊतक या अलग neurospheres) से तैयार किया जा सकता है. / वयस्क और भ्रूण माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) ऊतकों को काटना या अलग कर देना / वयस्क भ्रूण व्युत्पन्न के रूप में 1,2 और फिर से पहले वर्णित neurospheres:
- एकल कक्ष निलंबन 40 सुक्ष्ममापी आकार एक जाल फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है ताकि के रूप में गैर - अलग clumps को हटाने के लिए.
- 10μl सेल निलंबन के Trypan नीले 90μl एक कोशिका गिनती प्रदर्शन के साथ मिलाया जाता है नोट: अन्य उपयुक्त कक्ष dilutions भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्राथमिक भ्रूण या वयस्क तंत्रिका कोशिकाओं व्युत्पन्न का उपयोग कर अगर, 6.5 x 10 5 / पूरा एनएससी मध्यम में कोशिकाओं एमएल के एक एकाग्रता के लिए सेल निलंबन पतला. यदि dissociated वयस्क या भ्रूण तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न neurospheres से कोशिकाओं का उपयोग, 2.2 x 10 5 / पूरा एनएससी मध्यम में कोशिकाओं एमएल के एक एकाग्रता के लिए सेल निलंबन पतला.
3. अर्ध ठोस मध्यम एन CFCA में चढ़ाना कक्ष:
- निम्नलिखित घटकों की उचित मात्रा क्रम में मिलाया जाता है, प्रतिकृति की संख्या पर निर्भर करता है. यहाँ हम दो लोगों के लिए आवश्यक राशि प्रतिकृति मिश्रण या डुप्लिकेट व्यंजन. प्रतिकृति के अतिरिक्त संख्या के लिए, 1 टेबल के लिए उल्लेख कृपया .
- साइटोकिन्स के बिना 1.7 एमएल NeuroCult NCFC सीरम मुक्त मध्यम
- NeuroCult एनएससी प्रसार की खुराक की 330 μL
- 6.6 EGF की μL (10μg/mL)
- पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 32 μL
- ख FGF (10μg/mL) के 3.3 μL की आवश्यकता सिर्फ अगर संवर्धन कोशिकाओं वयस्क तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न.
- हेपरिन (0.2%) 3.3 μL की आवश्यकता सिर्फ अगर संवर्धन कोशिकाओं वयस्क तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न.
- सेल निलंबन की (2.2 x 10 5 / dissociated neurospheres या 6.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल dissociated CNS ऊतक से प्राथमिक कोशिकाओं से कोशिकाओं एमएल कोशिकाओं के) नोट: अंतिम सेल मढ़वाया संख्या 35 मिमी संस्कृति डिश के अनुसार लगभग 2500 कोशिकाओं 25μL होना चाहिए neurosphere ली गई कोशिकाओं और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए 35 मिमी संस्कृति डिश प्रति 7500 कोशिकाओं के लिए. कुछ मामलों में अंतिम सेल चढ़ाना घनत्व के लिए एक सेल अनुमापन प्रयोग का प्रदर्शन करके समायोजित किया जा है. 150 कालोनियों - सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, संस्कृति के 21 दिनों के बाद पता चला कालोनियों की कुल संख्या कम से कम 50 की सीमा के भीतर होना चाहिए.
- कोशिकाओं से युक्त मध्यम और फिर धीरे से मिलाया जाता है ठंड कोलेजन समाधान के 1.3 एमएल सेल निलंबन के लिए स्थानांतरित कर रहा है और कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित करने के लिए किसी भी बुलबुले को शुरू करने से बचने के.
- प्रत्येक 35 मिमी संस्कृति डिश (~ 1.5 एमएल / पकवान) के केंद्र के लिए मिश्रित समाधान तिरस्कृत और व्यंजन धीरे चलो मिश्रण पकवान की सतह पर समान रूप से फैला एक परिपत्र गति का उपयोग इत्तला दे दी है. .
- डुप्लिकेट 35 मिमी संस्कृति बर्तन एक 100 मिमी पेट्री प्लेट में रखा जाता है. नए 35 मिमी डिश के ढक्कन हटा दिया है और खुला पकवान भी एक ही 100 मिमी पेट्री डिश में रखा गया है. बाँझ पानी इस खुले 35 मिमी पकवान में जोड़ा जाता है के लिए ऊष्मायन अवधि के दौरान इष्टतम नमी बनाए रखने के लिए. स्क्वायर bioassay प्लेटें (245 मिमी) का उपयोग किया जाता है जब अधिक को दोहराने के 35 मिमी व्यंजन गठन किया गया है. फिर, 2 या 3 खुले 35 मिमी बाँझ पानी युक्त व्यंजन शामिल हैं.
- प्लेटों के 37 में एक मशीन सेट करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 और 95% आर्द्रता. बढ़ती तापमान और जेल गठन से कोलेजन congeals लगभग एक घंटे के भीतर हो जाएगा. संस्कृतियों के इस समय के दौरान परेशान नहीं किया जाना चाहिए.
- संवर्धित कोशिकाओं को 21 दिनों (कॉलोनी आकार में अंतर स्पष्ट रूप से 21 दिनों के बाद प्रतिष्ठित किया जा सकता है) के लिए incubated हैं.
4. पुनःपूर्ति मध्यम और संस्कृति को दूध पिलाने की तैयारी:
के रूप में एन CFCA संस्कृतियों समय (21 दिन) की एक विस्तारित अवधि के लिए incubated हैं, संस्कृतियों उपयुक्त पूरा NeuroCult साथ खिलाया होना चाहिए पुनःपूर्ति मध्यम निम्नानुसार ताजा तैयार:
- NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम के 4.5 एमएल 0.5 मीटर के साथ मिलाया जाता हैNeuroCult एनएससी प्रसार और फिर पूरक वृद्धि कारकों के एल जोड़ा है:
- 10μg/mL EGF के 250 μL (0.5 μg / एमएल EGF के अंतिम एकाग्रता दे)
- ख FGF 10μg/mL (ख FGF 0.25μg/mL के अंतिम एकाग्रता दे) के 125 μL की आवश्यकता सिर्फ अगर संवर्धन कोशिकाओं वयस्क तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न .
- 0.2% हेपरिन के 125 μL आवश्यक है, सिर्फ अगर संवर्धन कोशिकाओं वयस्क तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न .
- उपयुक्त पूरा NeuroCult पुनःपूर्ति मध्यम (भ्रूण या वयस्क कोशिकाओं के लिए) के 60 μL पूरे NCFC परख संस्कृति ऊष्मायन (21 दिन) के दौरान हर 7 दिनों में एक बार प्रत्येक NCFC परख डिश के केंद्र में जोड़ा जाता है.
5. एन सीएफसी परख व्युत्पन्न कालोनियों स्कोरिंग और सदाशयी एनएससी और तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की आवृत्ति की गणना :
- प्रत्येक 35 मिमी संस्कृति डिश ग्रिड आकार 2.0 मिमी x 2.0 मिमी के साथ एक gridded स्कोरिंग पकवान पर रखा जाता है और फिर दोनों व्यंजन खुर्दबीन मंच पर रखा जाता है.
- उद्देश्य लेंस, प्रत्येक पकवान स्कैन और कालोनियों उनके आकार के आधार पर अंक दिए जाते हैं - कम बिजली का उपयोग करना (5X 2.5X).
- कालोनियों के दो प्रमुख श्रेणियों में वर्गीकृत कर रहे हैं:
- कम से कम 2 मिमी व्यास
- ≥ 2 मिमी व्यास
6. प्रतिनिधि परिणाम:
(चित्रा 1) के 7 दिनों के चढ़ाना के बाद - neurosphere परख में, एन - सीएफसी परख में मढ़वाया कोशिकाओं को पैदा करना और 3 के भीतर कोशिकाओं के छोटे कालोनियों बनाने शुरू. दो सप्ताह के समय में, विभिन्न आकारों की कालोनियों प्रतिष्ठित किया जा सकता है. जबकि कालोनियों के बहुमत के लिए 14 दिनों के बाद बढ़ बंद करते हैं, कुछ कालोनियों के आकार में वृद्धि जारी है. 21 दिन तक कालोनियों को चार श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: 1) कम से कम 0.5 मिमी व्यास, 2) 0.5 - 1 मिमी व्यास, 3) 1 - 2 मिमी व्यास और 4 व्यास में) 2mm ≥. व्यावहारिक रूप से, 2 मिमी व्यास की तुलना में छोटे कालोनियों को संदर्भित कर रहे हैं पूर्वज व्युत्पन्न के रूप में (चित्रा 2) और कालोनियों ≥ 2mm करने के लिए व्यास में संदर्भित कर रहे हैं के रूप में एनएससी व्युत्पन्न (चित्रा 3). कुल मढ़वाया कोशिकाओं प्रति व्यास 2mm ≥ कालोनियों की संख्या, वास्तविक सदाशयी लंबी अवधि के आत्म नवीकरण और बहु संभावित क्षमताओं के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है . कुल एक विशेष सेल की आबादी में एक समानांतर एनएसए प्रयोग में 7-8 दिन के बाद आवृत्ति बनाने neurosphere कुल कॉलोनी एन CFCA प्रयोग में 21 दिनों के बाद एक ही सेल की आबादी की आवृत्ति बनाने के लिए इसी तरह की होने का अनुमान है. एन CFCA तथापि, एक और अधिक अनुमोदक हालत इतनी के रूप में प्रत्येक कोशिका अपनी पूरी proliferative क्षमता दिखा सकते हैं प्रदान करता है.
| घटक | 2 प्रतिकृति | 3 प्रतिकृति | 4 प्रतिकृति |
| साइटोकिन्स बिना NeuroCult NCFC सीरम मुक्त मध्यम | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult एनएससी प्रसार की खुराक | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 μg / एमएल) | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| (10 μg / एमएल) केवल वयस्क कोशिकाओं के लिए, bFGF | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| हेपरिन (0.2%) केवल वयस्क कोशिकाओं के लिए समाधान , | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| पर कोशिकाओं: 2.2 x 10 5 संवर्धित कोशिकाओं / एमएल या 6.5 10 एक्स 5 प्राथमिक कोशिकाओं / एमएल | 25 | 37.5 | 50 |
| कोलेजन समाधान | 1300 | 1950 | 2600 |
तालिका 1 पूरा परख एन सीएफसी संस्कृति के घटक.
चित्रा 1. एन CFCA बीतने एक E14 माउस एनएससी की संस्कृति में प्रतिनिधि कालोनियों चढ़ाना 7 दिनों के बाद . कालोनियों अलग आकारिकी और आकार प्रदर्शित हो सकता है. मूल आवर्धन, 4x
चित्रा 2 एन CFCA पारित होने की संस्कृति में विभिन्न आकारों चढ़ाना के 21 दिनों के बाद एक E14 माउस एनएससी के प्रतिनिधि पूर्वज व्युत्पन्न कालोनियों. के रूप में दिखाया गया है, कालोनियों आकारिकी अलग है, लेकिन सभी आकार में कम 2 मिमी हैं. मूल आवर्धन, 4x
चित्रा 3 प्रतिनिधि वास्तविक फाइड स्टेम सेल चढ़ाना के 21 दिनों के बाद एक E14 माउस एनएससी के पारित होने के एन CFCA संस्कृति में कॉलोनी निकाली गई. स्टेम सेल व्युत्पन्न कालोनियों आकारिकी अलग प्रदर्शित (देख सकते हैं) वीडियो लेकिन सभी व्यास में ≥ 2mm हैं. मूल आवर्धन, 4x
Discussion
हालांकि neurosphere 3,1,2 परख सबसे आम विधि को अलग और वयस्क और भ्रूण ऊतक सीएनएस की तरह स्रोतों की एक किस्म से तंत्रिका स्टेम सेल का विस्तार है, यह सही तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में एनएससी आवृत्ति उपाय नहीं कर सकते हैं ( स्टेम और progenitors) के रूप में वहाँ neurospheres की संख्या और सदाशयी स्टेम 4 कोशिकाओं की संख्या के बीच एक से एक रिश्ता नहीं है . इस सीमा का पता करने के लिए, मूल एनएसए इतनी अनुकूलित किया गया है के रूप में तंत्रिका स्टेम और progenitors तीन 5-7 हफ्तों के लिए अपनी पूरी प्रसार क्षमता को विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए. तरल एनएसए के विपरीत, एन CFCA कालोनियों वास्तव clonally प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में अर्द्ध ठोस कोलेजन मैट्रिक्स एकल चढ़ाया और कोशिकाओं कालोनियों के एकत्रीकरण के प्रवास रोकता है. हम इस परख के साथ संगत परिणामों के लिए सिफारिश:
- मूल सेल निलंबन में एक एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करें. 40 सुक्ष्ममापी आकार एक जाल फिल्टर के माध्यम से अपने एकल कक्ष निलंबन तो दर्रा के रूप में गैर - अलग clumps को हटाने के लिए.
- कोलेजन समाधान बर्फ पर या 4 ° सी फ्रिज में रखें. कोलेजन आखरी सेल निलंबन के मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा के रूप में यह तापमान में वृद्धि से congeals आइटम है.
- हर हफ्ते संस्कृति फ़ीड करने के लिए मत भूलना. पुनःपूर्ति वृद्धि कारक (ओं) को एक बार हर 7 दिनों युक्त मध्यम जोड़ना कोशिकाओं में फैला संस्कृति अवधि पैदा जारी रखने की अनुमति देगा.
- अंतिम सेल चढ़ाना घनत्व या तो प्राथमिक या सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं से व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है ताकि संस्कृति के 21 दिनों बाद पता चला कालोनियों की कुल संख्या NCFC कम से कम 50 की सीमा के भीतर है - 200 कालोनियों. इस रेंज के नमूने में व्यास में दुर्लभ एनएससी व्युत्पन्न 2mm> कालोनियों का पता लगाने की अनुमति देता है, जबकि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कालोनियों के लिए पर्याप्त संख्या उपलब्ध कराने. शुरू सेल स्रोत पर निर्भर करता है, काफी कम (<50 और कालोनियों की उच्च संख्या) (> 250) कभी कभी प्राप्त कर रहे हैं. बहुत कुछ कालोनियों कालोनियों> 2mm में पता लगाने के स्तर से नीचे जा रहा व्यास में परिणाम है, जबकि भी कई कालोनियों मध्यम विकास एक गलत कॉलोनी गिनती में जिसके परिणामस्वरूप घटकों के भीड़भाड़ anddepletion में परिणाम होगा. इसलिए सेल चढ़ाना घनत्व तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता (यानी बढ़ती या कोशिकाओं मढ़वाया की कुल संख्या घटते)
Disclosures
लेखकों की एक शेरोन ए लुइस, StemCell टेक्नोलॉजीज इंक, कुछ इस अध्ययन में इस्तेमाल अभिकर्मकों के एक निर्माता के साथ संबद्ध है.
Acknowledgments
इस काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
