इन विट्रो में मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) में हेरफेर करने की क्षमता के लिए उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए सेल प्रत्यारोपण के रूप में उनकी उपयोगिता की जांच करने के लिए और मानव तंत्रिका विकास का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल अनुसंधान की बढ़ती reproducibility की उम्मीद में संवर्धन और passaging hNSPCs की एक विधि प्रस्तुत करता है.
Abstract
इन विट्रो में मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) में हेरफेर करने की क्षमता उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए सेल प्रत्यारोपण के रूप में उनकी उपयोगिता की जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में मानव तंत्रिका विकास और विकृति के कई मौलिक प्रक्रियाओं का पता लगाने का मतलब है प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल इस तकनीक के मानकीकरण और मानव स्टेम सेल अनुसंधान के reproducibility बढ़ाने की उम्मीद में संवर्धन और passaging hNSPCs की एक सरल विधि प्रस्तुत करता है. hNSPCs का उपयोग हम शव का प्रसव के बाद मस्तिष्क cortices से राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन द्वारा अलग थे और बड़े के रूप में बोतल पर पक्षपाती संस्कृतियों fibronectin (Palmer एट अल, 2001.; Schwartz एट अल, 2003) के साथ लेपित. हम संस्कृति एक DMEM में हमारे hNSPCs: F12 सीरम मुक्त मीडिया EGF, FGF, और PDGF के साथ पूरक है और उन्हें बीतने 01:02 हर लगभग सात दिन. इन शर्तों का प्रयोग, संस्कृति में कोशिकाओं के बहुमत एक द्विध्रुवी आकारिकी बनाए रखने और undifferentiated तंत्रिका स्टेम सेल (जैसे nestin और Sox2 के रूप में) के मार्करों व्यक्त.
Protocol
नोट: हमारे hNSPCs की दिनचर्या संवर्धन के लिए, हम हर दूसरे दिन है और आमतौर पर उन्हें बीतने 01:02 मीडिया के 50-100% परिवर्तन एक सप्ताह में एक बार. F12 के आधार मीडिया: संस्कृति मीडिया 20% बिट 9500, 1X DMEM में एंटीबायोटिक / antimycotic, औ?…
Discussion
हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल hNSPCs के विश्वसनीय संस्कृतियों प्रदान करता है. हमारी कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है कि वे काफी घने संस्कृतियों के रूप में रखा जाना और passaged कहना है कि कोशिकाओं को विरल हैं नहीं कर …
Acknowledgements
लेखकों आभार डॉ. फिलिप एच. Schwartz बच्चों के अस्पताल, उनके संवर्धन में hNSPCs और प्रारंभिक अनुदेश प्रदान करने के लिए ऑरेंज काउंटी अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन को स्वीकार करते हैं.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)
Reagent
Stem Cell Technologies
09500
Antibiotic-Antimycotic
Reagent
Invitrogen
15240-062
DMEM:F12 (1X)
Reagent
Invitrogen
11330-032
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum
Reagent
Invitrogen
10437-028
FGF, human basic recombinant
Reagent
Peprotech
100-18B
PDGF-AB
Reagent
Peprotech
100-00AB
EGF, human recombinant
Reagent
BD Biosciences
CB40052
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2
Tool
Corning
10-126-28
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural
Reagent
BD Biosciences
CB40008A
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells
Cells
National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture.Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).