2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

Summary

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。

Abstract

消化管の後に、肺は脊椎動物の身体と環境との相互作用のための二番目に大きい面である。同時に、正常な呼吸時に吸入されている複数の病原体による感染を回避しながら、ここで、効果的なガス交換は、維持されなければならない。これを達成するために、体液性および細胞性免疫の仕組みの組み合わせ防衛戦略の見事なセットが存在する。肺の急性防衛のための最も効果的な対策の一つは、吸入病原体を貪食や細胞毒性化学物質を放出することによって、それらを殺す好中球の動員、です。好中球の武器に最近追加された細菌やカビがキャッチまたはNET放出する細胞が死んだ後であっても不活性化できるようにするための細胞外DNA - NETSの彼らの爆発的なリリースです。我々は、彼らが感染組織全体で生産されていることを豊富なNETSを視覚化するだけでなく、真菌病原体を貪食、最近感染した肺内移行は、ここには直接好中球を観察できるようにする方法を提示する。方法は、7時間金型アスペルギルスフミと多色タイムラプス2光子顕微鏡によるその審査の分生子を有するマウスの気管内感染後に厚い実行可能な肺のスライスの準備について説明します。このアプローチは、直接ネイティブの肺組織における抗真菌防御を調査することができますので、肺の免疫の詳細な調査のための新しい道を開きます。

Protocol

1。感染症

1. 金型アスペルギルスフミ （株ATCC 46645）の腫れ分生子は、5％FCS（v / v）で添加したRPMI 1640（Biochrom AG、ベルリン、ドイツ）でのプレインキュベーションによって生成されます。 2 × 10 ⁷安静時の分生子を5 mlの培地に再懸濁し、6ウェル組織培養プレート（TPP AG、Trasadingen、スイス、カタログ＃92006）でインキュベートされている37 7H ° Cの
2. 6ウェルにも含まれている各アスペルギルスに、腫れ期間の後、胞子は、蛍光calcofluor白のストック溶液（DMSOに[25 mg / mlの]シグマアルドリッチ、Deisenhofen、ドイツ、カタログ＃F3543）の10μlを添加することにより表示されていますプレート、50μg/ mlのRPMIの最終calcofluor濃度に達する。穏やかに混合に続いて、胞子は37℃でさらに15分間インキュベートする
3. 次のステップでは、胞子を70μmのセルストレーナー（BD Biosciences社、ハイデルベルグ、ドイツ）を通して濾過することにより収穫されます。 10ミリリットルのPBS（室温で5分間900xgで遠心）で1回洗浄した後ペレットを2 mlのPBSとノイチャンバーでカウントすることによって決定腫れ分生子の総数に再懸濁されている。最後に、胞子懸濁液を室温で5分間900xgで停止している、上清を注意深く除去し、ペレットは100μlのPBSあたり1x107胞子の最終濃度に再懸濁される。
4. 感染症の場合は、胞子溶液100μlを雌マウス（8-10週齢C57/BL6、、ハーラン、ドイツ）に気管内に適用されます。好中球は、同様に観察される場合は、リゾチームのプロモーター¹でEGFPを運ぶのLys - EGFPマウスの使用は、推奨されます。 150μlのケタミン/ Rompunソリューションの単一のIP注射で動物を麻酔することから始めます（Inresa Arzneimittel GmbHは、フライブルク、ドイツ（ケタミン）とバイエルバイタル社、レバークーゼン、ドイツ（Rompun）、1mlのケタミン[50 mg / mlの] + 0.5ミリリットルRompun [2％] + 3.5 mlの滅菌塩化ナトリウム[0.9％]）。 5分後に麻酔マウスは、挿管（補足の図1）を容易にするためにランプ（すなわち傾斜面）に、その歯によってゴムバンドで固定することができます。鉗子を使用して、舌が片側に引っ張られていると22G留置静脈カテーテル（B. BraunはAG、メルズンゲン、ドイツ、Vasofix Braunüleは）穏やかにガチョウの首のランプで恒久的な照明の下で気管に挿入することができます。カテーテルの挿入が成功したことは、人工呼吸器の周波数を持つ動物の胸郭の定期的な運動を観察することによって検証されます。成功した挿管が確認されているときは、100μlの胞子懸濁液を100μlのマイクロピペットを用いて適用されます。このボリュームは1〜2秒の任意の追加の助けなしに動物が吸入してください肺内部の真菌の粒子の強化された分布は、機械的に毎分250回の呼吸の速度と300の吸入量で小動物の呼吸（MiniVent、ヒューゴサックス、3月Hugstetten、ドイツ）で2分間感染動物を換気することによって達成される息当たりμL（補足の図2）。後に感染動物はそれらのケージに戻され、再び外来まで、5分ごとに観察される。マウスは、以下の潜伏期間中の痛みや苦痛の証拠を示していない。

2。肺の準備

1. 動きと呼吸が30秒以上止まっているまで、胞子感染後7時間は、動物はイソフルランの過剰摂取（バクスター社、Unterschleiβheim、ドイツ）により安楽死されています。これは、その後、臨床死を確保し、気管や肺の可視化とアクセスを可能にするために二次的方法として、開胸が続いている。その後、胸は慎重に肺や上気道を公開するために開かれます。その後、別の22G留置静脈カテーテルは、露出喉頭蓋から始まる気管に挿入されます。この細管を通って肺を、1ml Omnifix注射器（B. Braunの）を使用して1ミリリットル予め温めておいた低融点アガロース（2％w / vの、プロメガ社、マンハイム、ドイツ）で満たされている。とすぐに肺が満たされるように気管が縫製糸の短い断片をオフに固定されており、全体の動物は、4℃で冷蔵庫に入れている℃を
2. 15分後、アガロースが固化したときに、全体の肺は気管から始まる切り出される。先の尖ったハサミを使用して、右肺の葉がその後削除され、底面は簡単にティッシュペーパーのシート上に乾燥させ、その後全体の葉は、ビブラトーム（カムデンインスツルメンツ、英国、752M Vibrosliceの準備のブロックに糊付けされています）固定（カールロート社、カールスルーエ、ドイツ、ロティ-コル1）のための組織接着剤を一滴も使わず。 1分後にブロックは、あらかじめ冷却（4℃）PBSで満たされているビブラトーム、のカッティングチャンバにインストールされています。ビブラトームは、ミッドレンジの振動（最大10のうち5。）及びそのようなの水平断面その程度の速度（最大10のうち5。）に設定されています肺が生成されます。オルガンの上半分は、それが並列ナイロンスレッドのセットで覆われている自作のフラットワッシャー（1センチメートル内径）、で反転して固定されている小さなプラスチック製のペトリ皿（5 cmの直径）に転送されます離れてそれぞれの1ミリメートル（補足図3）。最後に、ペトリ皿を10 mlのPBSで5μMの最終色素濃度で得られたDNA色素SYTOXオレンジ[5 mMの]（Invitrogen社製、ドイツ）の10μlを添加したが充填されている。

3。 2光子レーザー顕微鏡

1. 肺のサンプルを含むペトリ皿は、バッファが℃の温度センサー制御ヒーター（補足の図4）で37に温めることができるように顕微鏡対物レンズの下にインストールされています。 2光子顕微鏡は、20xNA1.0水浸レンズ（ツァイス、イエナ、ドイツ）を装備した直立アクシオ審査の段階でツァイスLSM 710 NLO顕微鏡を使用して全体の切断面を介して行われます。イメージングのために、セクションに沿って別のエリアが緑（530 nm）と赤色（580 nm）の蛍光だけでなく、第二高調波発生（SHG）信号と検出800nm​​の照明波長を用いて400μmの深さにダウンスキャンされます外部非デスキャン検出器（NDD）と青calcofluor蛍光（400〜470 nmの発光時）。 2次元画像とタイムラプスムービー（1画像ごとに5〜10秒）に加えて、単一または反復的な3次元画像のスタックは、その後使用してボクセルレンダリングまたは単一の拡張焦点画像や4次元のデータ（時間をかけて3D）としてレンダリングすることができます別のソフトウェアパッケージ。この顕微鏡のセットアップでは、それが空気中の病原体のさまざまなエントリのポートを構成すると、膨大な免疫学的関連性のある、ほぼそのままの環境での細胞挙動の観察を可能にします。金型アスペルギルスフミと感染後の内因性好中球による細胞運動、食作用と純生産量は簡単にその場の状況でこれらの下で調べることができます。

4。代表的な結果

または3色のスライドやムービー - 行われている場合は、適切に画像処理は2が生成されます。色づけは後処理の手順で行われるため、自由に適応可能なされていますが、我々は一般的に相対的なチャネルで検出される染料/信号の自然な色を、反映したカラースキームを選択します。現在、EGFP -標識細胞が緑色に染色されている場合このように、SYTOX染料が赤色で描かれ、真菌だけでなく、SHG信号は、青で表示しています。最初の例では（図1）青色SHG信号は、組織の非感染肺の繊維と赤SYTOX信号が肺常駐細胞の核が生成されるビブラトームで開いているカットを示しています。両方、肺胞の構造と同様に真菌塊が、青色で表示される場所核とネットが赤色染色されている間、2番目の例（図2）に感染した肺は、示されている。第三の例（図3）は青と赤の構造に加えて、緑色の好中球も見ることができるのLys - EGFPトランスジェニック動物からのものです。好中球と時間経過のシーケンス内の個々の真菌要素の彼らの食作用の移行は、補足的な映画の中で示されています。

図1。 2色2光子顕微鏡の非感染性肺スライスの外観。肺のスライスは、非感染C57/BL6マウスから調製し、プロトコールに記載のように画像化した。ここで紹介するが、肺胞組織の構造（）のSHG信号である、細胞核のSYTOX信号は、肺のスライス（B）、および2つのチャンネル（C）のオーバーレイの準備中に開いてカット。 （C）の箱入りの領域は（D）に拡大して見られている。上記のように肺の呼吸活性領域内で明確に肺組織に比べて肺のスライスの下部に線維組織に注意してください。

図2。 2色2光子顕微鏡におけるアスペルギルス感染した野生型の動物の肺のスライスの外観。A.との前に7時間を感染C57/BL6マウスから肺のスライスフミは準備とプロトコルで説明されているように画像化した。示されているのは複合菌の構造とSHGの肺胞組織の（）、DNAのNETSのSYTOX信号だけでなく、細胞核が肺のスライス（B）の準備中に、オープンカット、そして二つのチャンネルの重ね合わせ（C）です。 。 （C）の箱入りの領域は（D）に拡大して見られている。注意してください、はっきりと明確な真菌塊の区域、肺胞、およびNET -構造はそれぞれ、文字F、及びNでマークされます。

図3。 3色2光子顕微鏡におけるアスペルギルス感染のLys - EGFPの動物の肺のスライスの外観。と前のLys - EGFPマウスに感染した7時間の肺のスライスA.フミを用意し、プロトコルで説明されているように画像化した。示されているのは複合菌の構造とSHG肺胞組織の（青）、細胞核とNETS（赤）のSYTOX信号だけでなく、同​​様に多数の好中球（緑）です。

補足図1。挿管のためのマウスの固定は。ケタミン/ Rompun麻酔下で動物が22G留置静脈カテーテルを挿管を容易にするために、その歯でゴムバンドで固定されています。

補足図2。機械式マウスの換気。挿管マウスは100μlのPBSに再懸濁した1 × 10 ⁷胞子のITアプリケーションに感染している。肺内部の真菌の粒子の強化された分布は、機械的に小動物の呼吸に感染したマウスを換気することによって達成される。

補足の図3。肺葉の固定。右肺の葉の調製後の臓器は、並列ナイロンスレッドのセットで覆われている実験室で作られた平ワッシャを使用してシャーレに固定されています。

補足の図4。 2光子イメージングセットアップ。右肺の葉を含むペトリ皿は、DNA色素SYTOXオレンジの添加後、2光子顕微鏡下で加熱マットの上にインストールされています。

補足映画：。菌感染後の生活の肺スライス7時間の2光子顕微鏡タイムラプスで見られるように移行し、 アスペルギルス感染した肺に真菌要素を貪食好中球好中球は緑、真菌要素であり、SHGは青であり、そして細胞の核としてだけでなく、NET -構造は赤で描かれている。実験の実時間は右下に表示されます。スケールバーは50μmを示しています。 ビデオを見るためにここをクリック

Discussion

in vivoでまたは無傷の臓器のリアルタイム2光子顕微鏡は、過去10年間の免疫細胞の生理機能を扱う研究で深遠な重要性を増している。それはリンパ節内T細胞活性化の動力学のような重要なイベントは、最初の^{2から4まで}見えるようになったというこの技法を使用していました。さらに最近では、研究者はまた、このアプローチ^5を使用してリンパ組織におけるエフェクター細胞の世代の最初のステップのような特定の細胞機能を解析し始めている。

しかし、新たな生物学的概念の数がこのメソッドを使って明らかにされているが、生体内可視化の研究はこれまでに公開されていないいる挑戦的かつ重要な疑問が残っています。特にこれは、哺乳類の肺に適用されます。このオルガンの興味深い側面は、空気中の病原体のさまざまなエントリポートとして、その免疫学的プロセスは、哺乳類の体内で行われる最も重要な面の一つです。全体の寿命上のすべての息をして、不要な粒子は、感染症⁶生命を脅かすを誘発する可能性を持っているそのうちの一部を吸入している。それはそのような敏感な、絶滅の危機にあるサイトでの防御機構のタイトなネットワークは、免疫応答の全体のレパートリーを示す存在している必要があることは自明です。一方、そのような"汚い"場所での潜在的な病原体に対する誘導免疫の戦いが厳密に制御されていることは非常に重要です。免疫系の誇張反応は大規模な非特異的免疫細胞のアクション^7,8の刺激により臓器組織を傷つけることによって自分の身体を傷つけるの高いリスクを負うものとします。

これらの思考に照らして、それはin vivo条件下で真の下で哺乳類の肺の細胞の挙動を調査する可能性を持っている非常に興味深いと役に立つでしょう。しかし、そのようなシステムはこれまで正常に機能してプロトコルを設定するには解決しなければならない大きな困難に明確にポイントを実装されていないという事実。最も要求の厳しい課題は、おそらくフォーカス安定性です。呼吸の責任臓器として肺に吸入を実現するためのスペースの3つすべての方向に一定の動きの下です。単独でこのような状況は、深刻なイメージングの問題が発生し、生体内イメージャ"悪夢"と考えることができます。すでに空間内の任意の次元へのわずかな動きでは意味のある画像^9を生成するために、マイクロメートルの精度で安定するように必要な顕微鏡視野、上に大規模な悪化の影響を持っています。その本質的にタイトなローカル焦点を与えられた^10、2光子顕微鏡は、焦点不安定性にさらに敏感であるZ方向のわずか数マイクロメートルの範囲内の特定の構造の転位として焦点の完全な損失に相当するためです。失敗した実験。

マウス肺内免疫細胞の観察のために本研究で提示プロトコルは、機能的に無傷の肺¹¹内の事態にも、in vivoでのアプリケーションではなく、近似値ではありません。植リンパの例イメージングリンパ球のex vivoでのアプローチは、ノードは^、12とこうして⁵関連性の高い生体観察で trueに相当する結果が得られることが示されている。我々のアプローチでのみ可能な肺のスライス、のその場観察で 、すぐに切除後の感染肺で行われる。切削加工時の3Dの整合性はアガロースマトリックス、肺の正確に制御切削加工を可能にするために不可欠なステップによって保証されています。それは、アガロースマトリックスの凝固を可能にするために、短い期間のための植肺を冷却する必要があるが、それは組織の切断および復温後の細胞のために近い生理的条件に戻すことが可能です。これは、明らかにこれらの条件下では好中球は非常にアクティブで、 アスペルギルスフミの感染症の効果的なクリアランスのために必要な機敏な食、など、その可能性を最大限に発揮することを示している我々のデータによって示されています。彼らは、肺胞の内側の部分に到達するために上皮障壁を通過する肺組織を巡回し、さらに、彼らは積極的に真菌の胞子11を取る。この作品の鍵の発見は、 アスペルギルス感染臓器に好中球細胞外トラップ（NETS）に似た構造の出現だった。 NETSは、好中球¹³の新たな防御機構の非常に最近の発見です。しかし、2004年の最初の記述以来、この現象が観察されているか、または欠けている動物モデルやヒトの生理学的または病理学的状態の数が爆発的に^14-16に増加している。興味深いことに、そんなに作業が非常に多くの異なるグループによってこれらの構造に費やされているものの、ほとんどのレポートは非​​常に説明的なレベルで残っているため、あまりです。NETのリリースとその調節のメカニズムについては知られています。我々のプロトコルで我々は、感染した肺でNET繊維を表示するために初めてできた。さらに、我々は、その発生または阻害¹¹のたて募集好中球と同様に分子の真菌の構造の重要性を実証することができます。これは明らかに、より詳細にNET形成の一つのステップを調査する手法の可能性を示しています。一つは、養子移入実験でNET形成の能力を観察するためにノックアウト適したマウスから好中球を使用する例については考えることができます。

このように、末梢血から好中球移民の直接観察が臓器植後の血液供給の不足のため、このシステムでは不可能ですが、我々はまだ我々のプロトコルが貴重とのイメージングを可能にするアプローチを処理することは比較的容易であると信じています肺の感染症に対する免疫防御の早朝または深夜のステップ。これは、したがって、生きている動物の呼吸の肺内でこの現象を調査するための重要な一歩です。