Прямое наблюдение Фагоцитоз и NET-формации Нейтрофилы в Зараженные легкие с помощью 2-фотонной микроскопии

Summary

Мы покажем, как использовать 2-фотонной микроскопии для наблюдения за динамикой нейтрофильных гранулоцитов в зараженных легких, пока они фагоцитируют патогены или производить нейтрофилов внеклеточной ловушек (НРТ).

Abstract

После желудочно-кишечного тракта, легких является второй по величине поверхность для взаимодействия между позвоночными тела и окружающей среды. Здесь, эффективного обмена газа должна быть сохранена, и в то же время избежать заражения нескольких патогенов, которые в виде ингаляций при нормальном дыхании. Чтобы добиться этого, превосходный набор стратегий защиты объединения гуморальный и клеточный иммунные механизмы существует. Одним из наиболее эффективных мер по острым защиту легких набора нейтрофилов, которые либо фагоцитируют вдыхании возбудителей или убить их, выпуская цитотоксические химические вещества. Недавнее дополнение к арсеналу нейтрофилами является их взрывного внеклеточной ДНК-НРТ помощью которых бактерии или грибы могут быть пойманы или инактивированных даже после NET выпуская клетки умерли. Мы приведем здесь метод, который позволяет непосредственно наблюдать нейтрофилы, мигрирующие в пределах недавно инфицированных легких, phagocytosing грибковых возбудителей, а также визуализировать обширные сети, которые они произвели всей инфицированной ткани. Метод описывается подготовка толстой жизнеспособной ломтиками легких 7 часов после интратрахеального инфекции мышей с конидий Aspergillus fumigatus плесень и их рассмотрения многоцветной покадровой 2-фотона микроскопии. Такой подход позволяет непосредственно исследовать противогрибковые обороны в родных легочной ткани и таким образом открывает новые возможности для детального исследования легочной иммунитет.

Protocol

1. Инфекция

1. Опухание конидий Aspergillus fumigatus плесень (штамм АТСС 46645) порождены предварительной инкубации в RPMI 1640 (Biochrom AG, Берлин, Германия) с добавлением 5% FCS (об. / об). 2x10 ⁷ отдыха конидий ресуспендируют в 5 мл среды и инкубировали в 6-и культуре ткани пластины (ТЭС AG; Trasadingen, Швейцарии, каталожный номер 92006) для 7ч при температуре 37 ° C.
2. После отек период, споры флуоресцентно меченных путем добавления 10 мкл calcofluor белый маточного раствора (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Германии, каталог # F3543; [25 мг / мл] в ДМСО) каждому Aspergillus содержащие также в 6-а пластины, достигнув конечной концентрации calcofluor 50 мкг / мл RPMI. После нежного смешивания, споры выдерживают в течение еще 15 минут при температуре 37 ° C.
3. На следующем этапе, споры собирают путем фильтрации через 70 мкм ячейки фильтра (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). После мытья один раз с 10 мл PBS (центрифуге при 900xg в течение 5 мин при комнатной температуре) осадок ресуспендируют в 2 мл PBS и общее количество опухшие конидий определяется путем подсчета с камерой Нойбауэр. Наконец суспензией спор вращается вниз на 900xg в течение 5 мин при комнатной температуре, супернатант тщательно удалены, и осадок ресуспендировали в конечной концентрации 1x107 спор на 100 мкл PBS.
4. Для заражения, 100 мкл спор раствор наносят интратрахеально в самок мышей (C57/BL6, 8-10 недель, Харлан, Германия). Если нейтрофилов, которые должны соблюдаться, а также, использование Lys-EGFP мышей, проведение EGFP под промотор лизоцима ¹ рекомендуется. Начните с обезболивающим животное с одной инъекции ф из 150 мкл кетамин / Rompun решение (Inresa Arzneimittel GmbH, Фрайбург, Германия (кетамин) и Bayer Vital GmbH, Леверкузен, Германия (Rompun), 1 мл кетамин [50 мг / мл] + 0,5 мл Rompun [2%] + 3,5 мл стерильного NaCl [0,9%]). Через 5 минут под наркозом мыши может быть исправлено с резинкой по его зубам рампы (т.е. наклонной поверхности) для облегчения интубации (дополнительный рисунок 1). Использование щипцов, язык тянет в одну сторону и 22G венозный катетер (B. Braun AG, Melsungen, Германии, Vasofix Braunüle) можно аккуратно вставляется в трахею под постоянным освещением с лампой шеи гуся. Успешной вставки катетер проверяется соблюдение регулярное движение грудной клетки животного с частотой механического вентилятора. При успешной интубации был подтвержден, 100 мкл суспензии спор применяется с использованием 100 мкл микропипетки. Этот объем должен быть вдыхаемого животным без дополнительной помощи в 1-2 сек Расширение распределения грибковых частиц внутри легких достигается за счет механической вентиляционной инфицированных животных в течение 2 минут с небольшим респиратор животных (MiniVent, Hugo Sachs, март-Hugstetten, Германия) в размере 250 вдохов в минуту и ​​ингаляции объемом 300 мкл на дыхание (дополнительный рисунок 2). После заражения животных вернулись в свои клетки и наблюдали через каждые 5 минут, пока амбулаторно снова. Мыши не показывают никаких признаков боли или страдания в течение следующего периода инкубации.

2. Легкое приготовление

1. 7 ч после заражения спорами, животное усыпляют от передозировки изофлуран (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Германия), пока движение и дыхание прекратились более чем на 30 секунд. Это затем следуют торакотомия в качестве вторичного метода для обеспечения клинической смерти и дать для визуализации и доступа трахеи и легких. Затем грудь осторожно открыл подвергать легких и верхних дыхательных путей. Потом еще 22G венозный катетер пребывающего вставляется в трахею, начиная от открытых надгортанника. Через эту трубочку легкие наполнены 1 мл подогретого низкой температурой плавления агарозы (2% м / о, Promega, Мангейм, Германия) с использованием 1 мл Omnifix шприц (B. Braun). Как только легкие заполняются трахеи связан прочь с небольшой фрагмент швейных ниток и целое животное помещается в холодильник при температуре 4 ° C.
2. 15 минут спустя, когда агарозном укрепил, весь легких вырезали начиная от трахеи. Используя пару заостренным ножницами, правой доли легкого, впоследствии удалена, нижней поверхности на короткое время сушат на лист папиросной бумаги, а затем всего доли приклеивается к подготовке блока vibratome (Campden инструменты, Великобритании, 752M Vibroslice ) с помощью капли ткани клей для фиксации (Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия, Roti-Coll 1). Через 1 мин блок устанавливается в камеру дробления из vibratome, которая заполнена предварительно охлажденной (4 ° С) PBS. Vibratome установлена ​​в середине диапазона вибрации (5 из 10 макс.), А также умеренной скоростью (5 из 10 макс.) Такие, что горизонтальном сечениилегких производится. Верхняя половина орган затем переносят в небольшие пластиковые чашки Петри (5 см в диаметре), где он инвертируется и фиксируется с самодельными плоскую шайбу (1 см внутренний диаметр), который покрывается набором параллельных потоков, нейлон, каждый 1 мм друг от друга (дополнительный рисунок 3). Наконец чашки Петри заполняют 10 мл PBS с добавлением 10 мкл ДНК красителя Sytox Оранжевый [5 мМ] (Invitrogen, Германия), в результате окончательной концентрации красителя из 5 мкМ.

3. 2-фотон лазерной микроскопии

1. Чашке Петри содержащих легких образец затем устанавливается под микроскопом цель, так что буфер может быть нагрета до 37 ° С, датчик температуры контролируемой нагреватель (дополнительный рисунок 4). 2-фотонной микроскопии при этом осуществляется по всей поверхности обработке с использованием Zeiss LSM 710 NLO микроскоп на вертикальном Axio Ревизора этапе оснащен 20xNA1.0 воды погружения линз (Zeiss, Jena, Германия). Для обработки изображений, различных районах вдоль разделе сканируются до 400 мкм глубины с помощью освещения длиной волны 800 нм обнаружения зеленый (530 нм) и красной (580 нм) флуоресценции, а также генерации второй гармоники (ГВГ)-сигнала и синий calcofluor флуоресценции (при 400-470 нм излучения) с внешним, не descanned детекторов (NDD). Кроме 2-D изображений и фильмов промежуток времени (1 изображение каждые 5-10 секунд), одиночные или повторяющиеся 3-мерные стеки картина может быть впоследствии отображается в виде воксела визуализации или одной большой изображений фокус или 4-D данных (3D с течением времени) с использованием различных программных пакетов. Этот микроскопический установка позволяет наблюдать сотовой поведения в почти неизменном виде среды, что, как он представляет собой запись порта для различных воздухе патогенных микроорганизмов, имеет огромное иммунологические актуальность. Сотовые подвижность, фагоцитоз и NET производство эндогенного нейтрофилов после инфицирования плесень Aspergillus fumigatus может быть легко исследованы в этих условиях на месте.

4. Представитель Результаты

Если все сделано правильно будет генерировать изображения 2 - или 3-цветных слайдов или фильмов. Хотя окраска производится в процедуре обработки почты и, таким образом, свободно адаптируются, мы обычно выбрать цветовую схему, отражающую естественный цвет красителя / сигнал, который обнаруживается в относительных канала. Таким образом, Sytox красителей изображены красным цветом, грибов, а также генерации второй гармоники сигнала показаны синим цветом и, если присутствует, EGFP-меченых клеток окрашиваются в зеленый цвет. В первом примере (рис. 1) синий сигнал ГВГ изображает ткань волокна неинфицированных легких и красный сигнал Sytox производится ядер легких-нерезидентов клетки разрезать на vibratome. Во втором примере (рис. 2) инфицированных легких показано, где оба, альвеолярных структур, а также грибковых масс, отображаются синим цветом, в то время ядер и сети окрашиваются красным цветом. Третий пример (рис. 3) составляет от Lys-EGFP трансгенных животных, где в дополнение к синим и красным структуры зеленых нейтрофилов может также рассматриваться. Миграции нейтрофилов и их фагоцитоз отдельных грибковых элементов в последовательности промежуток времени показана на дополнительном фильма.

Рисунок 1. Появление неинфицированных легких ломтик в 2-х цветный 2-фотонной микроскопии. Легкого срез был приготовлен из неинфицированных C57/BL6 мыши и отображаемого, как описано в протоколе. Здесь представлены ГВГ сигнал альвеолярной структуры тканей (А), Sytox сигнал клеточных ядер разрезать во время подготовки легких ломтик (B), и наложение двух каналов (С). Коробках области в (С) рассматривается увеличены в (D). Пожалуйста, обратите внимание фиброзной ткани в нижней части легких ломтик по сравнению с четко альвеолярного организации в дыхании-активных областей легких выше.

Рисунок 2. Появление легкого кусочек Aspergillus инфицированных диких животных типа в 2-х цветный 2-фотона микроскопии. Легкого среза от C57/BL6 мыши инфицированных 7 часов, прежде чем с А. fumigatus был подготовлен и отображаемого, как описано в протоколе. Показана комбинированные грибковых структуры и ГВГ альвеолярной ткани (), Sytox сигнал ДНК НРТ, а также ядра клеток разрезать во время подготовки легких ломтик (B), и наложение двух каналов (С) . Коробках области в (С) рассматривается увеличены в (D). Пожалуйста, обратите внимание, четко различные области грибковых масс, альвеолы, и NET-структур, помечены буквами F, и N, соответственно.

Рисунок 3. Появление легкого кусочек Aspergillus инфицированных Lys-EGFP животное в 3-цветный 2-фотонной микроскопии. Легкого кусочек Lys-EGFP мыши инфицированных 7 часов, прежде чем сA. fumigatus был подготовлен и отображаемого, как описано в протоколе. Показана комбинированные грибковых структуры и ГВГ альвеолярной ткани (синий), Sytox сигнал клеточных ядер и сети (красный), а также а также многочисленные нейтрофилы (зеленый).

Справочная рисунке 1. Мышь фиксации для интубации. Под кетамин / Rompun анестезии животного фиксируется с резинкой на своих зубов с целью облегчения интубации с 22G венозный катетер пребывающего.

Справочная рисунке 2. Механическая вентиляция мыши. Интубированных мышь заражена его применения 1x10 ⁷ споры ресуспендировали в 100 мкл PBS. Расширение распределения грибковых частиц внутри легких достигается за счет механической вентиляционной инфицированных мышей с небольшой респиратор животного.

Справочная рисунке 3. Легкого доли фиксации. После подготовки правой доли легкого органа фиксируется в чашку Петри с использованием лабораторных сделал плоскую шайбу на который распространяется набор параллельных нитей из нейлона.

Справочная рисунке 4. 2-фотонной визуализации установки. Чашке Петри содержащие правой доли легких устанавливается на нагревательный мат в 2-фотонного микроскопа после добавления ДНК красителя Sytox Orange.

Справочная фильме:. Нейтрофилы мигрируют и phagocytosing грибковых элементов в Aspergillus инфицированных легких с точки зрения промежуток времени 2-фотонной микроскопии живой срез легких 7 ч после заражения грибом Нейтрофилы зеленый, грибковые элементы и ГВГ синие, и клеточных ядер, а также NET-структур изображены красным цветом. Реальное время эксперимента показан на нижнем правом углу. Шкалы изображает 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео

Discussion

В режиме реального времени 2-фотона микроскопии в естественных условиях или в интактных органов приобрела глубокое значение для исследований, посвященных физиологии клетки иммунной системы в течение последних 10 лет. Именно с этой техникой, что важные события, как динамика активации Т-клеток в лимфатических узлах впервые стал видимым ^2-4. Совсем недавно ученые также начали анализировать специфические клеточные функции, как первые шаги в поколение эффекторных клеток в лимфатических тканях с использованием этого подхода ^5.

Однако, несмотря на ряд новых биологических понятий были выявлены с помощью этого метода, Есть еще сложные и важные вопросы, по которым не прижизненной визуализации исследований были опубликованы до сих пор. Примечательно это относится к млекопитающим легких. Интересный аспект этого органа, как вступление порт для различных воздухе патогенных микроорганизмов, делает его одним из самых важных поверхностей, на которых иммунологические процессы происходят в организме млекопитающих. С каждым дыханием в течение всей жизни, нежелательных частиц в виде ингаляций, некоторые из которых есть потенциал, чтобы вызвать опасные для жизни инфекции ^6. Это говорит само за себя, что в такой чувствительной и исчезающих сайт плотная сеть защитных механизмов должен присутствовать выставке весь репертуар иммунного ответа. С другой стороны, это очень важно, что индуцированная иммунологическая борьбы с потенциально патогенных микроорганизмов в такой "грязной" место под жестким контролем. Преувеличенные реакции иммунной системы несут высокий риск нанесения вреда собственному телу через широкомасштабное ранив ткани органа при стимуляции неспецифической иммунной действия ячейки ^7,8.

В свете этих мыслей было бы чрезвычайно интересно и полезно иметь возможность исследовать поведение клеток млекопитающих легкие под истинным в естественных условиях. Однако тот факт, что такая система до сих пор не были успешно реализованы ясно указывает на огромные трудности, которые должны быть решены в создании рабочей протокола. Наиболее трудная задача, вероятно, это сосредоточиться стабильности. Легких, как органа, ответственного за дыхание под постоянным движением во всех трех направлений пространства для реализации ингаляции. Уже одно это обстоятельство вызывает серьезные проблемы с изображениями и можно считать прижизненной тепловизоры "кошмар". Уже легкое движение, чтобы в любой размерности пространства массивным ухудшение влияние на микроскопическом зрения, которая должна быть стабильной микрометром точностью в целях получения значимых изображений ^9. Учитывая жесткие по своей сути подходом ^10, 2-фотонного микроскопа еще более чувствительны к координационным неустойчивости, как вывих определенную структуру в пределах от нескольких микрометров в Z-направлении эквивалентно полной потере внимания и, следовательно, Неудачный эксперимент.

Протокол, представленные в этом исследовании для наблюдения иммунные клетки в мышиный легких по-прежнему не в естественных условиях применения, но довольно близко приближение к ситуации в функционально нетронутыми легких ^11. Ex подходы естественных условиях для работы с изображениями лимфоцитов, например, в эксплантированных лимфатических узлы, как было показано, давать результаты эквивалентны истинным прижизненных наблюдений ¹² и, таким образом, весьма актуальной ^5. Наблюдений в точке в легких ломтиками, которые возможны только с нашим подходом, состоится в инфицированных легких вскоре после иссечения. 3D целостности во время процесса резки обеспечивается агарозном матрице, необходимым шагом, чтобы точно контролировать процесс резки из легких. Хотя это необходимо охладить эксплантированных легких в течение короткого периода, чтобы затвердевания агарозном матрицы, можно вернуться в ближайшее физиологические условия для клеток после резки и согревание тканей. Это ясно показывают наши данные, которые демонстрируют, что в этих условиях нейтрофилов обладают высокой активностью и проявляют весь свой ​​потенциал в качестве гибкой фагоцитов, которые необходимы для эффективной очистки инфекции Aspergillus fumigatus. Они патрулируют легочной ткани, проходящие через эпителиальные барьеры, чтобы достигнуть внутренней части альвеол и кроме того, они активно занимают грибковые споры 11. Основной вывод этой работы стало появление структур, напоминающих нейтрофилов внеклеточной ловушек (НРТ) в Aspergillus инфицированных органов. Сетки совсем недавнее обнаружение механизма романа обороны в нейтрофилов ^13. Тем не менее, с момента ее первоначального описания в 2004 году, ряд физиологических или патологических состояний на животных моделях или людей, где это явление наблюдается или не хватает был взрывным увеличением ^14-16. Интересно, что хотя так много работы было потрачено на эти структуры, так много различных групп, в большинстве докладов все еще находятся на очень описательный уровень и не так многоизвестно о механизме NET выпуска и ее регулирования. С нашей протокола мы смогли в первый раз, чтобы показать NET волокон в инфицированных легких. Кроме того, мы могли бы продемонстрировать важность недавно набранных нейтрофилов, а также молекулярные грибковых структур для их возникновения или торможения ^11. Это наглядно демонстрирует потенциал нашего метода для исследования одного шаги NET формирование более подробно. Можно было подумать, например, для использования нейтрофилов из подходящих нокаут мышей, чтобы наблюдать за их способности NET образования в приемные экспериментов передачи.

Таким образом, хотя прямого наблюдения нейтрофилов иммиграции из периферической крови не представляется возможным в этой системе из-за отсутствия кровоснабжения органов после эксплантации, мы все еще верим, что наш протокол является ценным и сравнительно просты в обращении подход, который позволяет визуализацию рано или поздно шагов в иммунной защиты от инфекций легких. Это, следовательно, важным шагом на пути исследования этого явления в легких дыхание живых животных.