2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

Summary

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

Abstract

위장관 후 폐는 척추 신체와 환경 사이의 상호 작용에 대한 두 번째로 큰 표면 수 있습니다. 동시에 정상적인 호흡하는 동안 흡입되는 여러 병원균에 의해 감염을 피할 수있는 동안 여기에서 효과적인 가스 교환이 유지되어야합니다. 이것을 달성하기 위해, 체액 및 세포 면역 메커니즘을 결합 방어 전략의 최상의 세트가 존재합니다. 폐의 급성 방어를위한 가장 효과적인 조치 중 하나는 하나 흡입 병원균을 phagocytose 또는 세포 독성 화학 물질을 방출하여 그들을 죽일 neutrophils의 채용입니다. neutrophils의 무기고에 최근에 또한 박테리아 또는 곰팡이가 잡힌 또는 NET 풀어 세포가 죽은 후에도 inactivated 될 수있는 세포 DNA - 그물들의 폭발적인 릴리스입니다. 우리는뿐만 아니라 그들은 감염된 조직을 통해 생산한다는 광범위한 그물을 시각화와 같은 곰팡이 병원균을 phagocytosing, 최근에 감염된 폐 내의 마이 그 레이션, 여기에 직접 neutrophils을 관찰 수있는 방법을 제시한다. 방법은 여러 가지 빛깔의 시간 경과 2 광자 현미경에 의해 7시간 금형 Aspergillus fumigatus 및 검사 conidia와 생쥐의 intratracheal 감염 후 두꺼운 가능한 폐 조각의 준비에 대해 설명합니다. 이러한 접근 방식은 하나의 직접 기본 폐 조직에 antifungal 방어를 조사 수 있으므로 폐의 면역의 세부 조사를위한 새로운 수단을 엽니다.

Protocol

1. 감염

1. 곰팡이 Aspergillus fumigatus (변형 ATCC 46645)을 부어 conidia가와 보충 RPMI 1640 (Biochrom AG, 베를린, 독일)의 사전 배양에 의해 생성됩니다 5% FCS (V / V). 2x10 ⁷ 휴식 conidia 5 ML 매체에 resuspended과 6 잘 조직 배양 플레이트 (TPP AG; Trasadingen, 스위스, 카탈로그 # 92006)에 incubated 아르 37 7h에 대한 ° C.
2. 6 - 음에 잘 포함하는 각 Aspergillus에, 붓기 기간에 따라, 포자는 찬란 calcofluor 흰색 주식 솔루션 (DMSO에서 [25 MG / ML] 시그마 알드리치, Deisenhofen, 독일, 카탈로그 # F3543) 10 μl를 추가하여 레이블 아르 판, 50 μg / ML RPMI의 최종 calcofluor 농도에 도달. 부드러운 혼합 후, 포자는 37 ° C.에서 추가 15 분 incubated 아르
3. 다음 단계에서는 포자는 70 μm의 셀 스트레이너 (BD Biosciences, 하이 델베르크, 독일)를 통해 여과하여 수확하고 있습니다. 10 ML PBS (실온에서 5 분 900xg에서 원심 분리기)를 한 번 세척 후 펠렛 2 ML PBS와 노이 바 우어 챔버와 계산에 의해 결정 부어 conidia의 총 숫자 resuspended 있습니다. 마지막으로 포자 현탁액을 실온에서 5 분 900xg에서 다운 소용이며, 뜨는 신중하게 제거하고, 펠릿 100 μl PBS 당 1x107 포자의 최종 농도 resuspended입니다.
4. 감염, 포자 용액 100 μl는 여성 마우스 (C57/BL6, 오래된 8~10주, 할렌, 독일)에 intratracheally 적용됩니다. neutrophils뿐 아니라 관찰하는 경우, 라이 소 자임의 promotor ¹ 아래 EGFP를 들고리스 - EGFP 마우스의 사용이 권장됩니다. 150 μl Ketamin / Rompun 솔루션 (Inresa Arzneimittel GmbH를, 프라이 부르크, 독일 (Ketamin)와 바이엘 바이탈 GmbH를, 레버쿠젠, 독일 (Rompun), 1 ML Ketamin [50 MG / ML]의 단일 IP 분사와 함께 동물을 anesthetizing로 시작 + 0.5 ML Rompun [2 %] + 3.5 ML 살균 NaCl [0.9 %]). 오분 후 anesthetized 마우스는 삽관법 (보충 그림 1)을 촉진하기 위해 진입로를 (즉, sloped 표면)에 이빨하여 탄성 밴드와 함께 해결할 수 있습니다. 포셉를 사용하여 혀는 한쪽과 22G 내재의 정맥 카테 테르 (B. 브라운 AG, Melsungen, 독일, Vasofix Braunüle) 부드럽게 구스 넥 램프와 영구적인 조명 아래 기관에 삽입이 될 수도 가져온 것입니다. 카테 테르의 성공적인 삽입은 기계적 인공 호흡의 빈도와 동물의 흉부 정기적으로 운동을 관찰하여 확인됩니다. 성공 삽관법이 확정되면, 100 μl 포자 현탁액을 100 μl micropipette를 사용하여 적용됩니다. 이 볼륨은 1-2 미국에서 추가 도움없이 동물에 의해 흡입해야합니다 폐 내부의 곰팡이 입자의 향상된 배포는 기계 분당 250 호흡 속도 300의 흡입 볼륨에서 작은 동물 인공 호흡기 (MiniVent, 휴고 삭스, 3 월 Hugstetten, 독일) 2 분 동안 감염된 동물을 환기에 의해 이루어집니다 호흡 당 μl (보충 그림 2). 감염 동물들은 케이지에 반환하고 다시 외래 때까지 5 분마다 관찰 후. 생쥐는 다음과 부화 기간 동안 통증이나 고통의 증거를 보여주지 않습니다.

2. 폐 준비

1. 포자와 감염 후 7 H는, 동물의 과다에 의해 euthanized이다 isoflurane (백스터 GmbH를, Unterschleiβheim, 독일) 움직임과 호흡이 30 초 이상 정지 때까지. 이것은 다음 임상 사망 보장 및 시각화와기도와 폐 액세스할 수 있도록 보조 방법으로 thoracotomy옵니다. 그러면 가슴이 조심스럽게 폐암과 상부 호흡기 트랙트을 폭로 열립니다. 그런 다음 다른 22G 내재의 정맥 카테 테르는 노출 후두개부터 기관에 삽입됩니다. 이 가느다란 관 통해 폐는 1 ML Omnifix 주사기 (B. 브라운)을 사용하여 한 ML 미리 예열 낮은 용융 아가로 오스 (2 % W / V, Promega, 만하임, 독일)로 가득합니다. 즉시 폐이 가득 같은 기관은 재봉 스레드의 짧은 조각으로 떨어져 연결되어 있으며, 전체 동물 4에서 냉장고에 넣고 ° C.를
2. 15 분 후, 아가로 오스가 확정되면, 전체 폐는기도에서 시작 excised 수 있습니다. 날카로운 지적 가위를 사용하여, 오른쪽 폐 엽이 이후에 제거, 바닥 표면은 간단히 조직 종이에 건조 후 전체 엽은 vibratome (캠덴 계측기, 영국, 752M Vibroslice의 준비 블록에 붙어있다 ) 고정 (칼 로스 GmbH를, 칼스 루에, 독일, Roti - 콜 1) 조직 접착제 한 방울을 사용하여. 1 분 후, 블록이 미리 냉장 (4 ° C) PBS으로 가득합니다 vibratome의 커팅 챔버에 설치됩니다. vibratome는 중형 진동 (10 최대 5 밖으로.) 또한 중간 속도 (5 밖으로 10 맥스.) 이러한되는 수평 단면으로 설정됩니다폐이 생산됩니다. 기관의 위쪽 절반이 다음은 병렬 나일론 스레드의 집합이 적용되는 자수 성가 플랫 와셔 (1cm 내경)과 거꾸로 및 고정되는 작은 플라스틱 페트리 접시 (5cm 직경)로 전송 분리 각 1mm (보충 그림 3). 마지막으로 페트리 접시 10 ML PBS는 DNA 염색 Sytox 오렌지 5 μm의의 최종 염료 농도의 결과 [5 MM] (Invitrogen, 독일)의 10 μl와 보충으로 가득합니다.

3. 2 - 광자 레이저 현미경

1. 폐 샘플을 포함하는 페트리 접시는 다음 버퍼 ° C의 온도 센서 조절 히터 (보충 그림 4)에 의해 37 예열 수 있도록 현미경 목표 아래에 설치됩니다. 2 광자 현미경은 다음 20xNA1.0 물 수영 렌즈 (자이스 혈구, 예나, 독일)가 장착된 수직 Axio 심사관 무대에서 자이스 혈구 LSM 710 NLO 현미경을 사용하여 전체 절단 표면을 통해 수행됩니다. 이미징 들어, 섹션 따라 서로 다른 영역은 녹색 (530 나노미터)과 빨간색 (580 NM) 형광뿐만 아니라, 두 번째 고조파 세대 (SHG) 신호와 검출 800 NM의 조명 파장을 사용하여 400 μm의 깊이로 스캔 외부 비 descanned 탐지기 (NDD)와 블루 calcofluor 형광 (400-470 nm의 방출에서). 2 - D 이미지와 시간 경과 영화 (1 이미지를 모든 50-10초) 게다가, 단일 또는 반복적인 3 차원 사진 스택은 이후 사용 voxel 렌더링하거나 하나의 확장 초점을 이미지 또는 4 - D 데이터 (시간이 지남에 따라 3D)으로 렌더링할 수 다른 소프트웨어 패키지. 이 미세한 설정은 공중 병원균의 다양한 항목 포트를 구성 같은 거대한 면역 관련입니다, 거의 손상되지 환경에서 세포 행동의 관찰하실 수 있습니다. 세포 운동성, phagocytosis 및 곰팡이 Aspergillus fumigatus와 감염에 따라 내생 neutrophils에 의해 NET 생산 쉽게 현장 조건에서 이러한하에 조사 수 있습니다.

4. 대표 결과

완료하면 제대로 영상 2를 생성합니다 - 또는 3 - 컬러 슬라이드이나 영화. 색채가 사후 처리 절차 완료되므로 자유롭게 적응력이다하지만, 우리는 일반적으로 상대적인 채널에 감지 염료 / 신호의 자연 색상을 반영하는 색칠 구성표를 선택합니다. 따라서 Sytox 염료가있는 경우, EGFP - 라벨이 세포가 녹색으로 물들어 있으며, 빨강, 균류뿐만 아니라 SHG 신호가 파란색으로 표시됩니다에 묘사된하고 있습니다. 첫 번째 예제에서 (그림 1) 푸른 SHG 신호는 조직이 아닌 감염된 폐의 섬유 붉은 Sytox 신호 폐 상주 세포의 핵에 의해 생산되는 vibratome 공개 몫을 모습. 모두, 폐포 구조뿐만 아니라 곰팡이 대중이 파란색으로 나타납니다 어디에 핵 및 그물이 빨간색으로 물들어있는 동안 두 번째 예제 (그림 2)에 감염된 폐는, 표시됩니다. 세 번째 예제 (그림 3) 청색과 적색 구조 이외에 녹색 neutrophils도 볼 수리스 - EGFP 형질 전환 동물에서이다. neutrophils 및 시간 저속 시퀀스에서 개별 곰팡이 요소들의 phagocytosis의 마이 그 레이션은 보충 영화에 표시됩니다.

그림 1. 2 컬러가 아닌 감염된 폐 슬라이스의 모양은 2 광자 현미경. 폐 슬라이스가 아닌 감염 C57/BL6 마우스 준비와 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 폐포 조직 구조 (A)의 SHG 신호가 여기에 제시 세포 핵의 Sytox 신호가 폐암 슬라이스 (B), 두 채널 (C)의 오버레이의 준비 기간 동안 오픈 했네요. (C)의 박스 영역 (D)의 확대 볼 수 있습니다. 위 폐의 호흡 활성 영역 내에서 명확하게 폐포 조직에 비해 단면 폐의 하단에있는 섬유 조직을 유의하시기 바랍니다.

그림 2. 2 컬러 Aspergillus 감염 야생 형식 동물의 폐 슬라이스 2 광자 현미경의 모습. 7 H를 감염 C57/BL6 마우스 폐 슬라이스 A.와 함께하기 전에 fumigatus는 준비하고 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 표시 통합 곰팡이 구조와 SHG 폐포 조직 (A), DNA의 그물의 Sytox 신호뿐만 아니라 세포 핵은 폐 슬라이스 (B)의 준비 기간 동안 오픈 컷, 두 채널의 오버레이 (C)입니다 . (C)의 박스 영역 (D)의 확대 볼 수 있습니다. 주의, 곰팡이 대중, 폐포 및 NET - 구조의 명확 고유한 영역이 글자 각각 F, A와 N과 함께 표시됩니다.

그림 3. 3 컬러 Aspergillus 감염리스 - EGFP 동물의 폐 슬라이스의 모양은 2 광자 현미경.리스 - EGFP 마우스의 폐 슬라이스 함께 전에 7 H 감염A. fumigatus는 준비하고 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 표시 통합 곰팡이 구조와 SHG 폐포 조직 (파란색), 세포 핵 및 그물 (적색)의 Sytox 신호뿐만뿐만 아니라 수많은 neutrophils (녹색)입니다.

보충 그림 1. 삽관법에 대한 마우스 고정가. Ketamin / Rompun 마취 동물은 22G 내재의 정맥 카테터와 삽관법을 촉진하기 위해서는 치아에서 탄성 밴드와 함께 고정됩니다.

보충 그림 2. 기계식 마우스 환기가. intubated 마우스는 100 μl PBS에 resuspended 1x10 ⁷ 포자의 그것 응용 프로그램에 의해 감염됩니다. 폐 내부의 곰팡이 입자의 향상된 배포는 기계식 작은 동물 인공 호흡기로 감염된 마우스를 환기에 의해 이루어진다.

보충 그림 3. 폐 엽 고정가. 오른쪽 폐 엽의 준비 후 기관은 병렬 나일론 스레드의 집합에 의해 덮여 있습니다 실험실 만든 평면 와셔를 사용하여 페트리 접시에서 해결되었습니다.

보충 그림 4. 2 - 광자 이미징 설치. 오른쪽 폐 엽을 포함 페트리 접시는 DNA 염색 Sytox 오렌지를 추가 후 2 광자 현미경 난방 매트에 설치됩니다.

보충 동영상 :. 균류와 감염 후 살아있는 폐 슬라이스 7 H 2 - 광자 현미경 시간 경과로 볼 수로 마이 그 레이션 및 Aspergillus 감염 폐의 곰팡이 요소를 phagocytosing Neutrophils Neutrophils은 녹색, 곰팡이 요소이며, SHG은 파란색이며, 세포 핵으로 뿐만 아니라 NET - 구조는 빨간색으로 그려져있다. 실험의 실제 시간은 오른쪽 하단에 표시됩니다. 스케일 바는 50 μm의를 묘사. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오

Discussion

생체내 또는 그대로 장기 실시간 2 광자 현미경은 지난 10 년 동안 면역 세포의 생리학을 다루는 연구에 깊은 중요성을 받고있다. 이것은 림프절 내에서 T - 세포 활성화의 역학과 같은 중요한 이벤트가 처음 ^2-4 보게되었습니다이 기술되었다. 최근 연구자들은 또한이 접근 방법 ^5를 사용하고 림프 조직의 효과기 세포의 생성의 첫 번째 단계와 같은 특정 세포 기능을 분석하기 시작했습니다.

새로운 생물 학적 개념의 다수가이 방법을 사용하여 발표하고 있지만 그러나, 여전히 도전적이고 더 intravital 시각화 연구는 지금까지 공개되지 않았습니다있는 중요한 질문이있다. 특히 이것은 포유류의 허파에 적용됩니다. 이 기관의 흥미로운 측면은, 출격 병원균의 다양한 입력 포트로, 그것 면역 프로세스가 포유류의 신체에서 이루어지는되는 가장 중요한 표면 중 하나를합니다. 전체 수명 동안 숨쉬기를 통해 원하지 않는 입자는 감염 ⁶ 생명에 위협을 유발하는 잠재력을 갖고있는 중 일부를 흡입하고 있습니다. 그것은 민감하고 멸종 위기에 처한 사이트에서 방어 메커니즘의 긴밀한 네트워크가 면역 반응의 전체 레퍼토리를 전시 존재한다는 것을 스스로 설명이다. 반면에 이러한 "더러운"장소에서 잠재적인 병원균에 대한 면역 유도 시합이 꽉 제어하는​​ 것이 매우 중요합니다. 면역 시스템의 과장된 반응이 매우 unspecific 면역 세포 행동 ^7,8의 자극에 따라 장기 조직을 손상하여 자신의 신체를 손상의 높은 위험을 부담.

이런 생각에 비추어 그것은 생체내 조건에서 진정한에 따라 포유류의 폐 세포의 동작을 조사할 수있는 가능성을 가지고 매우 흥미 있고 도움이 될 것입니다. 그러나, 이러한 시스템이 지금까지 성공적으로 작동하는 프로토콜을 설정으로 해결할 수있는 엄청난 어려움을 분명 포인트 구현되지 않은 사실. 가장 까다로운 과제는 아마도 초점 안정성입니다. 호흡에 대한 책임 기관으로 폐는 흡입을 실현하기 위해 공간 세 가지 방향으로 지속적인 움직임을 받고있다. 혼자이 상황은 심각한 이미징 문제를 원인과 intravital imagers "악몽"을 고려하실 수 있습니다. 이미 우주의 모든 차원에 약간의 움직임은 의미있는 이미지에게 ⁹ 생성하기 위해 마이크로 미터의 정밀도와 안정되어야 미세한보기에 거대한 악화 효과가 있습니다. 는 본질적으로 꽉 지방 초점을 감안할 때 ^10, 2 광자 현미경은 초점 불안에 더욱 민감한 Z - 방향으로 몇 micrometers의 범위에서 특정 구조의 전위로 초점의 전체 손실에 해당하므로입니다 실패한 실험.

murine 폐 내의 면역 세포의 관찰이 연구에서 제시 프로토콜은 기능 손상 폐를 ¹¹ 상황에 아직도 생체내 응용 프로그램이 아니라 근접에 없습니다. explanted 림프의 예 이미징 lymphocytes에 대한 전 생체내 접근은 노드는 생체내 관찰 ¹² true로 동일한 결과를 얻을 수로 표시하므로 ⁵ 관련성이있다. 우리의 접근 방식에서만 가능 폐 슬라이스에서 현장 관측에이 곧 절단 후 감염된 폐에서 열립니다. 절단 과정에서 3D 무결성은 아가로 오스 매트릭스, 폐의 정확하게 제어 가공 과정을 허용하는 필수적인 단계에 의해 보장됩니다. 그것은 아가로 오스 모체의 응고 수 있도록 짧은 기간 동안 explanted 폐 냉각을 필요가 있지만, 그것은 커팅과 조직의 rewarming 후 세포 주변의 생리적 조건에 반환이 가능합니다. 이것은 분명히 이러한 조건 하에서 neutrophils 높은 활성과 Aspergillus fumigatus 감염의 효과적인 통관에 필요한 민첩 phagocytes로 자신의 잠재력을 전시 것을 보여줍니다 우리의 데이터가 표시됩니다. 그들은 폐포의 내부 부품에 도달하기 위해서는 상피 장벽을 통과 폐 조직을 순찰하고 나아가 그들은 적극적으로 곰팡이 포자에게 11 차지. 이 작품의 주요 발견은 Aspergillus 감염 장기에서 호중구 세포 트랩 (그물)과 유사한 구조의 모양을했습니다. 네츠는 neutrophils ¹³ 소설 방어 메커니즘의 아주 최근 찾고 있습니다. 그러나, 2004 년 초기 설명부터, 동물 모델이나이 현상이 관찰되었거나 부족한 인간 생리적 또는 병리 학적 조건의 수가 explosively ^{14-16 향상되었습니다.} 흥미롭게도, 많은 작품이 이렇게 많은 다른 그룹에 의해 이러한 구조에 지출되어 있지만, 대부분의 리포트는 매우 설명 수준 여전히 아닌 정도입니다NET 릴리스의 메커니즘과 그 규제에 관한 알려져 있습니다. 우리 프로토콜로 우리는 감염된 폐에​​ NET 섬유를 표시하기 위해 처음으로 수 있었다. 또한, 우리는 그들의 발생 또는 억제 ¹¹ 갓 모집 neutrophils뿐만 아니라 분자 곰팡이 구조의 중요성을 입증 수 있습니다. 이것은 분명히 더 자세히 NET 형성의 한 단계를 조사하기 위해 우리의 방법의 가능성을 보여줍니다. 하나는 입양 전송 실험에서 NET 형성 자신의 능력을 관찰하는 노크 아웃 마우스에서 적합한 neutrophils를 사용하는 예를 들어 생각을 할것입니다.

주변 혈액의 호중구 이민의 직접 관찰이 장기 explantation 후 혈액 공급의 부족으로 인해이 시스템 수는 없지만 따라서, 우리는 여전히 우리 프로토콜의 이미지를 허용 처리하는 가치와 상대적으로 쉽게 접근이라고 믿는 폐 감염에 대한 면역 방어에 일찍 또는 늦게 단계를 반복합니다. 이것은, 그러므로, 살아있는 동물의 호흡이 폐 내에있는이 현상을 조사 향한 중요한 단계입니다.