Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Summary

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Abstract

Dopo il tratto gastrointestinale, il polmone è il secondo più grande superficie per l'interazione tra il corpo dei vertebrati e l'ambiente. Qui, un efficace scambio di gas deve essere mantenuto, e al tempo stesso evitare il contagio da agenti patogeni multipli che vengono inalati durante la respirazione normale. Per raggiungere questo obiettivo, una serie di strategie di difesa superba combinazione di meccanismi immunitari umorali e cellulari esiste. Una delle misure più efficaci per la difesa acuta del polmone è il reclutamento dei neutrofili, che o fagocitare i patogeni inalati o ucciderli rilasciando sostanze citotossiche. Una recente aggiunta all'arsenale di neutrofili è il loro rilascio esplosivo di DNA extracellulare-NET da cui i batteri o funghi possono essere catturati o inattivato, anche dopo che le cellule rilasciando NET sono morti. Vi presentiamo qui un metodo che permette di osservare direttamente neutrofili, la migrazione all'interno di un polmone recentemente infettati, phagocytosing patogeni fungini e visualizzare i NET estesa che hanno prodotto in tutto il tessuto infetto. Il metodo descrive la preparazione di spesse fette di polmone vitale 7 ore dopo l'infezione endotracheali di topi con conidi della muffa Aspergillus fumigatus e il loro esame da multicolore time-lapse 2-fotone microscopia. Questo approccio permette di studiare direttamente difesa antifungina nel tessuto polmonare nativa e apre così una nuova strada per lo studio dettagliato di immunità polmonare.

Protocol

1. Infezione

1. Conidi Gonfiore della muffa Aspergillus fumigatus (ceppo ATCC 46645) sono generati da pre-incubazione in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlino, Germania) arricchito con 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ riposo conidi sono risospesi in 5 ml di mezzo e incubato in un 6-pozzetti di coltura tissutale (TPP AG; Trasadingen, Svizzera, catalogo # 92006) per 7 ore a 37 ° C.
2. Dopo il periodo di gonfiore, le spore sono fluorescente aggiungendo 10 ml di soluzione calcofluor fondo bianco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Germania, catalogo # F3543, [25 mg / ml] in DMSO) per ogni Aspergillus contiene bene in 6-bene piastra, raggiungendo una concentrazione finale calcofluor di 50 mg / ml RPMI. A seguito di miscelazione gentile, le spore vengono incubate per altri 15 minuti a 37 ° C.
3. Nella fase successiva, le spore vengono raccolte mediante filtrazione attraverso una cella di 70 micron filtro (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). Dopo il lavaggio, una volta con 10 ml di PBS (centrifugare a 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente) il pellet è risospeso in 2 ml di PBS e il numero totale di conidi gonfie determinata contando con una camera di Neubauer. Infine la sospensione di spore è filato giù al 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente, il supernatante viene accuratamente rimosso e il pellet risospeso alla concentrazione finale della 1x107 spore per 100 l di PBS.
4. Per l'infezione, 100 ml di soluzione di spore è applicata intratracheally in topi di sesso femminile (C57/BL6, 8-10 settimane, Harlan, Germania). Se neutrofili devono essere osservate pure, l'uso di Lys-EGFP topi, portando EGFP sotto il promotore lisozima ¹ è consigliata. Inizia l'anestesia l'animale con una sola iniezione ip di 150 microlitri Ketamin / Rompun soluzione (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germania (Ketamin) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germania (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml di NaCl sterile [0.9%]). 5 minuti più tardi il mouse anestetizzato può essere fissato con un elastico per i suoi denti alla rampa (cioè una superficie inclinata) per facilitare l'intubazione (supplementare figura 1). Utilizzando pinze, la lingua è tirata da un lato e un 22G catetere venoso a permanenza (B. Braun AG, Melsungen, Germania, Vasofix Braunüle) può essere delicatamente inserito nella trachea sotto illuminazione permanente con una lampada a collo d'oca. L'inserimento di successo del catetere è verificata osservando il movimento regolare del torace dell'animale con la frequenza del ventilatore meccanico. Quando l'intubazione di successo è stato confermato, 100 microlitri della sospensione di spore si applica con un 100 microlitri micropipetta. Questo volume deve essere inalato con l'animale, senza alcun aiuto supplementare in 1-2 s. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all'interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione l'animale infetto per 2 minuti con un respiratore piccolo animale (Minivent, Hugo Sachs, marzo-Hugstetten, Germania) al tasso di 250 respiri al minuto e un volume inalazione di 300 microlitri per ogni respiro (supplementare figura 2). Dopo gli animali infezione sono tornati alle loro gabbia e osservato ogni 5 minuti fino ambulatoriale di nuovo. I topi non mostrano alcuna evidenza di dolore o disagio durante il periodo di incubazione successivo.

2. Preparazione del polmone

1. 7 ore dopo l'infezione con le spore, l'animale è eutanasia da una dose eccessiva di isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Germania) fino a quando i movimenti e la respirazione hanno smesso per più di 30 secondi. Questo viene poi seguita da toracotomia come metodo secondario per assicurare la morte clinica e consentire la visualizzazione e l'accesso della trachea e polmoni. Poi il petto è aperta con cura per esporre i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Poi un altro 22G catetere venoso a permanenza viene inserito nella trachea a partire dalla epiglottide esposti. Attraverso questo tubulo i polmoni sono pieni di 1 ml preriscaldata fusione agarosio bassa (2% w / v, Promega, Mannheim, Germania) con un 1 ml Omnifix siringa (B. Braun). Non appena i polmoni sono pieni della trachea è legato con un breve pezzo di filo per cucire e l'intero animale viene messo in frigorifero a 4 ° C.
2. 15 minuti più tardi, quando l'agarosio si è solidificato, il polmone intero è escisse a partire dalla trachea. Utilizzando un paio di forbici taglienti a punta, il lobo del polmone destro è successivamente rimosso, la superficie inferiore è brevemente asciugato su un foglio di carta velina e poi l'intero lobo è incollato al blocco preparazione di un (Campden Instruments, Regno Unito, vibratome 752M Vibroslice ) utilizzando una goccia di adesivo per il fissaggio del tessuto (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania, Roti-Coll 1). Dopo 1 min il blocco è installato nella camera di taglio del vibratome, che è pieno di pre-raffreddata (4 ° C) PBS. Il vibratome è impostato su un mid-range di vibrazione (5 su 10 max.) E anche la velocità moderata (5 su 10 max.) Tale che una sezione orizzontale delpolmone è prodotta. La metà superiore del organo è poi trasferito in un piccolo piatto di plastica Petri (5 cm di diametro), dove è invertita e fissata con un self-made rondella piatta (1 cm di diametro interno) che è coperto da un insieme di fili di nylon in parallelo, ogni 1 mm l'una dall'altra (supplementare figura 3). Infine il piatto di Petri è riempito con 10 ml di PBS supplementato con 10 ml di colorante DNA Sytox Arancio [5 mm] (Invitrogen, Germania), con conseguente concentrazione finale di tintura di 5 micron.

3. 2-fotone microscopia laser

1. La piastra di Petri contenente il campione del polmone viene poi installato sotto il microscopio obiettivo in modo che il buffer può essere riscaldato a 37 ° C da un sensore di temperatura controllata riscaldamento (supplementare figura 4). 2-fotone microscopia viene poi effettuata sulla superficie di taglio tutto utilizzando un microscopio Zeiss LSM 710 NLO su un palco eretto Axio Examiner dotata di un obiettivo 20xNA1.0 acqua immersione (Zeiss, Jena, Germania). Per l'imaging, diverse aree lungo la sezione vengono sottoposti a scansione fino a 400 micron di profondità con una lunghezza d'onda di 800 nm illuminazione rilevazione verde (530 nm) e rosso (580 nm) fluorescenza, così come la generazione di seconda armonica (SHG)-segnale e il blu calcofluor fluorescenza (emissione a 400-470 nm) con rilevatori esterni non descanned (NDD). Oltre 2-D immagini e filmati lasso di tempo (1 immagine ogni 5-10 secondi), singoli o ripetitivi 3-dimensionale pile foto può essere successivamente reso come rendering voxel o singole immagini messa a fuoco estesa o 4-D di dati (3D nel tempo) con differenti pacchetti software. Questa configurazione permette l'osservazione microscopica del comportamento cellulare in un ambiente quasi intatto, che, in quanto costituisce la porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni aerodispersi, è di enorme rilevanza immunologica. Motilità cellulare, fagocitosi e la produzione endogena NET da parte dei neutrofili dopo l'infezione con la muffa Aspergillus fumigatus può essere facilmente studiato in queste condizioni in situ.

4. Rappresentante Risultati

Se fatto correttamente l'imaging genererà 2 - o 3-colore diapositive o filmati. Anche se la colorazione è fatto in una procedura di post-elaborazione ed è quindi liberamente adattabile, generalmente selezionare uno schema di colorazione che riflette il colore naturale del colorante / segnale, che viene rilevato nel canale relativo. Così, i coloranti Sytox sono rappresentati in rosso, il fungo così come il segnale SHG è mostrato in blu e, se presente, EGFP-etichettati cellule sono colorate in verde. Nel primo esempio (Fig. 1) il segnale SHG blu raffigura le fibre di un tessuto non infetto del polmone e il segnale rosso Sytox è prodotto da nuclei di cellule del polmone residenti taglio aperto dal vibratome. Nel secondo esempio (Fig. 2) un polmone infetto viene mostrato, dove entrambi, strutture alveolari così come masse fungine, appaiono in blu, mentre i nuclei e reti sono macchiate di rosso. Il terzo esempio (Fig. 3) è da un Lys-EGFP animale transgenico dove oltre alle strutture blu e rosso i neutrofili verde può anche essere visto. La migrazione dei neutrofili e la loro fagocitosi dei singoli elementi fungini in sequenze lasso di tempo viene mostrato nel film supplementare.

Figura 1. L'aspetto di un non-infetti fetta di polmone in 2 colori 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone è stato preparato da un non-infetti C57/BL6 mouse e ripreso come descritto nel protocollo. Qui presentate sono il segnale SHG della struttura del tessuto alveolare (A), il segnale Sytox dei nuclei cellulari taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C). L'area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare il tessuto fibroso alla base del polmone fetta rispetto alla organizzazione chiaramente all'interno della respirazione alveolare-attiva aree del polmone di cui sopra.

Figura 2. La comparsa di una fetta del polmone di un animale infetto tipo Aspergillus selvatici in 2-color 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone da un mouse C57/BL6 infettato 7 ore prima con A. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (A), il segnale di Sytox NET DNA così come i nuclei delle cellule taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C) . L'area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare, le aree ben distinte delle masse fungine, alveoli, e NET-strutture sono contrassegnate con le lettere F, A e N, rispettivamente.

Figura 3. La comparsa di una fetta di un polmone infetto Aspergillus Lys-EGFP animale in 3-color 2-fotone microscopia. Una fetta di un polmone Lys-EGFP topo infettato 7 ore prima conA. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (blu), il segnale Sytox dei nuclei delle cellule e NET (rosso), così come pure numerosi neutrofili (verde).

Supplementare figura 1. Fissazione del mouse per l'intubazione. Sotto Ketamin / Rompun anestesia l'animale è fissato con un elastico al suo denti al fine di facilitare l'intubazione con un catetere venoso 22G interiore.

Supplementare figura 2. Ventilazione meccanica del mouse. Il mouse intubato è stato infettato da un Qualora l'applicazione delle 1x10 ⁷ spore risospesi in 100 l di PBS. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all'interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione il mouse infettato da un respiratore piccolo animale.

Supplementare figura 3. Fissazione del lobo del polmone. Dopo la preparazione del lobo del polmone destro l'organo è fissato in una capsula di Petri con l'uso di una rondella di laboratorio fatte piatto che è coperto da un insieme di fili di nylon paralleli.

Supplementare figura 4. 2-fotone configurazione imaging. La piastra di Petri contenente il lobo destro del polmone è installato su una stuoia di riscaldamento sotto il 2-fotone microscopio dopo l'aggiunta del colorante DNA Sytox Orange.

Supplementare film:. Neutrofili migrazione e phagocytosing elementi fungine da Aspergillus nei polmoni infettati visto dal lasso di tempo 2-fotone microscopia di una fetta di vita del polmone 7 ore dopo l'infezione con il fungo neutrofili sono verdi, elementi fungini e SHG sono blu, e nuclei delle cellule come così come NET-strutture sono rappresentate in rosso. Il tempo reale di questo esperimento viene mostrato in basso a destra. La barra di scala rappresenta 50 micron. Clicca qui per guardare il video

Discussion

In tempo reale 2-fotone microscopia in vivo o in organi intatti ha assunto un'importanza profonda negli studi che fare con la fisiologia delle cellule immunitarie negli ultimi 10 anni. E 'con questa tecnica che eventi importanti come le dinamiche di attivazione delle cellule T all'interno dei linfonodi prima divenne visibile ^2-4. Più di recente, i ricercatori hanno anche iniziato ad analizzare specifiche funzioni cellulari, come i primi passi nella generazione di cellule effettrici nei tessuti linfatici utilizzando questo approccio ^5.

Tuttavia, anche se un certo numero di nuovi concetti biologici sono stati rivelati con questo metodo, ci sono ancora sfide e questioni importanti per i quali non esistono studi di visualizzazione intravitale sono stati pubblicati finora. In particolare questo vale per i polmoni dei mammiferi. L'aspetto interessante di questo organo, come porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni nell'aria, la rende una delle superfici più cruciale in cui i processi immunologici hanno luogo nel corpo dei mammiferi. Con ogni respiro nel corso della vita intera, particelle indesiderate vengono inalate, alcune delle quali hanno il potenziale di indurre in pericolo di vita infezioni ^6. E si spiega da sé che in un sito sensibile e in via di estinzione una fitta rete di meccanismi di difesa deve essere presente esibendo tutto il repertorio di risposte immunitarie. D'altra parte è molto importante che la lotta contro i patogeni immunologico indotto potenziale in un posto così "sporco" è strettamente controllato. Reazioni esagerate del sistema immunitario sopportare un elevato rischio di danneggiare il proprio corpo in maniera massiccia da ferire i tessuti degli organi dopo la stimolazione di azioni non specifica delle cellule immunitarie ^7,8.

Alla luce di questi pensieri sarebbe estremamente interessante ed utile avere la possibilità di studiare il comportamento delle cellule nei polmoni dei mammiferi in vere condizioni in vivo. Tuttavia, il fatto che un tale sistema finora non è stato attuato con successo in modo chiaro i punti per le enormi difficoltà che devono essere risolti nella creazione di un protocollo di lavoro. La sfida più impegnativa è probabilmente la stabilità fuoco. Il polmone come organo responsabile per la respirazione è in movimento costante in tutte e tre le direzioni dello spazio per realizzare l'inalazione. Questa sola circostanza provoca gravi problemi di immagine e può essere considerato un intravitale imager "incubo". Già un leggero movimento a qualsiasi dimensione nello spazio ha un effetto enorme sul deterioramento della vista microscopico, che deve essere stabile con precisione micrometrica al fine di generare immagini significative ^9. Dato il suo accento intrinsecamente stretto locale ^10, 2-fotone microscopia è ancora più sensibile alle instabilità focale, come una lussazione di una certa struttura della gamma di appena pochi micrometri nella direzione Z è equivalente a una completa perdita di messa a fuoco e così un esperimento fallito.

Il protocollo presentato in questo studio per l'osservazione delle cellule immunitarie all'interno del polmone murino non è ancora in applicazione in vivo, ma una buona approssimazione la situazione in un polmone funzionalmente integro ^11. Approcci ex vivo dei linfociti immagini, ad esempio in linfa espiantati nodi, hanno dimostrato di produrre risultati equivalenti a vere osservazioni in vivo in ¹² e quindi sono molto importanti ^5. Le osservazioni in situ a fette polmone, che sono possibili solo con il nostro approccio, si svolgono in un polmone infetto poco dopo l'escissione. L'integrità 3D durante il processo di taglio è garantita dalla matrice di agarosio, un passo essenziale per consentire un processo controllato con precisione il taglio del polmone. Anche se è necessario raffreddare il polmone espiantati per un breve periodo per consentire una solidificazione della matrice di agarosio, è possibile tornare a condizioni quasi fisiologiche per le cellule e rewarming dopo il taglio del tessuto. Questo è chiaramente dimostrato dai nostri dati, che dimostrano che in queste condizioni neutrofili sono molto attivi e mostrano il loro pieno potenziale come fagociti agile, che sono necessari per la liquidazione effettiva di una infezione da Aspergillus fumigatus. Pattugliano il tessuto polmonare passando attraverso le barriere epiteliali per raggiungere le parti interne degli alveoli e inoltre si occupano attivamente spore fungine 11. Un risultato chiave di questo lavoro è stato la comparsa di strutture simili neutrofili trappole extracellulare (NET) nel Aspergillus organo infetto. NET sono una scoperta molto recente di un nuovo meccanismo di difesa nei neutrofili ^13. Tuttavia, sin dalla sua prima descrizione nel 2004, il numero di condizioni fisiologiche o patologiche in modelli animali e nell'uomo dove questo fenomeno è stato osservato che manca o è stato esplosivo aumento ^14-16. Curiosamente, sebbene tanto lavoro è stato speso per queste strutture da parte di gruppi così diversi, la maggior parte i rapporti sono ancora ad un livello molto descrittivo e non molto èsa del meccanismo di rilascio NET e la sua regolazione. Con il nostro protocollo siamo stati in grado per la prima volta a mostrare le fibre NET in un polmone infetto. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare l'importanza di neutrofili appena reclutati così come le strutture molecolari funghi per il loro verificarsi o inibizione ^11. Questo mostra chiaramente il potenziale del nostro metodo per indagare i singoli passaggi della formazione NET in modo più dettagliato. Si potrebbe pensare ad esempio per utilizzare neutrofili da topi knock-out adatto per osservare la loro capacità di formazione NET negli esperimenti di trasferimento adottivo.

Quindi, anche se l'osservazione diretta di immigrazione neutrofili dal sangue periferico non è possibile con questo sistema a causa della mancanza di afflusso di sangue dopo espianto dell'organo, continuiamo a credere che il nostro protocollo è un approccio importante e relativamente facile da gestire che permette l'imaging di passi presto o tardi nella difesa immunitaria contro le infezioni polmonari. Questo è, dunque, un passo importante verso indagare questo fenomeno all'interno del polmone respirazione di animali vivi.