我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ(NETS)を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。
消化管の後に、肺は脊椎動物の身体と環境との相互作用のための二番目に大きい面である。同時に、正常な呼吸時に吸入されている複数の病原体による感染を回避しながら、ここで、効果的なガス交換は、維持されなければならない。これを達成するために、体液性および細胞性免疫の仕組みの組み合わせ防衛戦略の見事なセットが存在する。肺の急性防衛のための最も効果的な対策の一つは、吸入病原体を貪食や細胞毒性化学物質を放出することによって、それらを殺す好中球の動員、です。好中球の武器に最近追加された細菌やカビがキャッチまたはNET放出する細胞が死んだ後であっても不活性化できるようにするための細胞外DNA – NETSの彼らの爆発的なリリースです。我々は、彼らが感染組織全体で生産されていることを豊富なNETSを視覚化するだけでなく、真菌病原体を貪食、最近感染した肺内移行は、ここには直接好中球を観察できるようにする方法を提示する。方法は、7時間金型アスペルギルスフミと多色タイムラプス2光子顕微鏡によるその審査の分生子を有するマウスの気管内感染後に厚い実行可能な肺のスライスの準備について説明します。このアプローチは、直接ネイティブの肺組織における抗真菌防御を調査することができますので、肺の免疫の詳細な調査のための新しい道を開きます。
in vivoでまたは無傷の臓器のリアルタイム2光子顕微鏡は、過去10年間の免疫細胞の生理機能を扱う研究で深遠な重要性を増している。それはリンパ節内T細胞活性化の動力学のような重要なイベントは、最初の2から4まで見えるようになったというこの技法を使用していました。さらに最近では、研究者はまた、このアプローチ5を使用してリンパ組織におけるエフェクター細胞の世代の最初のステップのような特定の細胞機能を解析し始めている。
しかし、新たな生物学的概念の数がこのメソッドを使って明らかにされているが、生体内可視化の研究はこれまでに公開されていないいる挑戦的かつ重要な疑問が残っています。特にこれは、哺乳類の肺に適用されます。このオルガンの興味深い側面は、空気中の病原体のさまざまなエントリポートとして、その免疫学的プロセスは、哺乳類の体内で行われる最も重要な面の一つです。全体の寿命上のすべての息をして、不要な粒子は、感染症6生命を脅かすを誘発する可能性を持っているそのうちの一部を吸入している。それはそのような敏感な、絶滅の危機にあるサイトでの防御機構のタイトなネットワークは、免疫応答の全体のレパートリーを示す存在している必要があることは自明です。一方、そのような"汚い"場所での潜在的な病原体に対する誘導免疫の戦いが厳密に制御されていることは非常に重要です。免疫系の誇張反応は大規模な非特異的免疫細胞のアクション7,8の刺激により臓器組織を傷つけることによって自分の身体を傷つけるの高いリスクを負うものとします。
これらの思考に照らして、それはin vivo条件下で真の下で哺乳類の肺の細胞の挙動を調査する可能性を持っている非常に興味深いと役に立つでしょう。しかし、そのようなシステムはこれまで正常に機能してプロトコルを設定するには解決しなければならない大きな困難に明確にポイントを実装されていないという事実。最も要求の厳しい課題は、おそらくフォーカス安定性です。呼吸の責任臓器として肺に吸入を実現するためのスペースの3つすべての方向に一定の動きの下です。単独でこのような状況は、深刻なイメージングの問題が発生し、生体内イメージャ"悪夢"と考えることができます。すでに空間内の任意の次元へのわずかな動きでは意味のある画像9を生成するために、マイクロメートルの精度で安定するように必要な顕微鏡視野、上に大規模な悪化の影響を持っています。その本質的にタイトなローカル焦点を与えられた10、2光子顕微鏡は、焦点不安定性にさらに敏感であるZ方向のわずか数マイクロメートルの範囲内の特定の構造の転位として焦点の完全な損失に相当するためです。失敗した実験。
マウス肺内免疫細胞の観察のために本研究で提示プロトコルは、機能的に無傷の肺11内の事態にも、in vivoでのアプリケーションではなく、近似値ではありません。植リンパの例イメージングリンパ球のex vivoでのアプローチは、ノードは、12とこうして5関連性の高い生体観察で trueに相当する結果が得られることが示されている。我々のアプローチでのみ可能な肺のスライス、のその場観察で 、すぐに切除後の感染肺で行われる。切削加工時の3Dの整合性はアガロースマトリックス、肺の正確に制御切削加工を可能にするために不可欠なステップによって保証されています。それは、アガロースマトリックスの凝固を可能にするために、短い期間のための植肺を冷却する必要があるが、それは組織の切断および復温後の細胞のために近い生理的条件に戻すことが可能です。これは、明らかにこれらの条件下では好中球は非常にアクティブで、 アスペルギルスフミの感染症の効果的なクリアランスのために必要な機敏な食、など、その可能性を最大限に発揮することを示している我々のデータによって示されています。彼らは、肺胞の内側の部分に到達するために上皮障壁を通過する肺組織を巡回し、さらに、彼らは積極的に真菌の胞子11を取る。この作品の鍵の発見は、 アスペルギルス感染臓器に好中球細胞外トラップ(NETS)に似た構造の出現だった。 NETSは、好中球13の新たな防御機構の非常に最近の発見です。しかし、2004年の最初の記述以来、この現象が観察されているか、または欠けている動物モデルやヒトの生理学的または病理学的状態の数が爆発的に14-16に増加している。興味深いことに、そんなに作業が非常に多くの異なるグループによってこれらの構造に費やされているものの、ほとんどのレポートは非常に説明的なレベルで残っているため、あまりです。NETのリリースとその調節のメカニズムについては知られています。我々のプロトコルで我々は、感染した肺でNET繊維を表示するために初めてできた。さらに、我々は、その発生または阻害11のたて募集好中球と同様に分子の真菌の構造の重要性を実証することができます。これは明らかに、より詳細にNET形成の一つのステップを調査する手法の可能性を示しています。一つは、養子移入実験でNET形成の能力を観察するためにノックアウト適したマウスから好中球を使用する例については考えることができます。
このように、末梢血から好中球移民の直接観察が臓器植後の血液供給の不足のため、このシステムでは不可能ですが、我々はまだ我々のプロトコルが貴重とのイメージングを可能にするアプローチを処理することは比較的容易であると信じています肺の感染症に対する免疫防御の早朝または深夜のステップ。これは、したがって、生きている動物の呼吸の肺内でこの現象を調査するための重要な一歩です。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、メソッドの開発中に有用な議論とコメントを慎重に原稿を読むための生体内ムービー、ドクタージョナサンLindquistさん、そしてGunzerの研究室のすべてのメンバーを最適化するとヘルプは博士ラースPhilipsenに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術振興(DFG、SFB 854)からMGへの補助金によって賄われていた