La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Summary

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

Abstract

Después de que el tracto gastrointestinal, el pulmón es el segundo mayor superficie para la interacción entre el cuerpo de los vertebrados y el medio ambiente. En este caso, un intercambio de gases eficaz debe mantenerse, mientras que al mismo tiempo evitar la infección por patógenos múltiples que se inhalan durante la respiración normal. Para lograr esto, un magnífico conjunto de estrategias de defensa que combina los mecanismos de inmunidad humoral y celular existe. Una de las medidas más eficaces para la defensa agudo de pulmón es el reclutamiento de neutrófilos, que fagocitan a los patógenos ya sea inhalado o matarlos por la liberación de productos químicos citotóxicos. Recientemente se ha incorporado al arsenal de los neutrófilos es su liberación explosiva de ADN extracelular-NET mediante el cual las bacterias o los hongos pueden ser capturados o inactivadas, incluso después de la liberación de las células NET han muerto. En este trabajo presentamos un método que permite observar directamente los neutrófilos, que migran dentro de un pulmón infectado recientemente, phagocytosing hongos patógenos, así como visualizar la TNE extensas que se han producido en todo el tejido infectado. El método describe la preparación de rodajas de pulmón viable siete horas después de la infección intratraqueal de ratones con conidios del hongo Aspergillus fumigatus y su examen por multicolor lapso de tiempo de 2 fotones microscopía. Este enfoque permite investigar directamente la defensa antifúngico en el tejido pulmonar nativa y por lo tanto se abre una nueva vía para la investigación detallada de la inmunidad pulmonar.

Protocol

1. Infección

1. Conidios hinchada del hongo Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) son generados por la pre-incubación en medio RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlín, Alemania) suplementado con 5% FCS (v / v). 2x10 ⁷ de descanso conidios se resuspenden en 5 ml de medio y se incubaron en una placa de tejido de 6 pocillos (TPP AG; Trasadingen, Suiza, catálogo # 92006) de 7 horas a 37 ° C.
2. Después del período de la inflamación, las esporas están marcados con fluorescencia mediante la adición de 10 l de solución calcofluor archivo (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemania, catálogo # F3543, [25 mg / ml] en DMSO) a cada uno de Aspergillus que contiene también en el de 6 pocillos placa, alcanzando una concentración final de calcofluor de 50 ug / ml RPMI. Después de mezclar suavemente, las esporas se incubaron durante 15 min a 37 ° C.
3. En el siguiente paso, las esporas se recogen por filtración a través de un filtro de 70 micras de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Después de lavar una vez con 10 ml de PBS (centrifugar a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente), el sedimento se resuspende en 2 ml de PBS y el número total de conidios hinchada determinado por contar con una cámara de Neubauer. Por último, la suspensión de esporas se centrifuga a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se retira cuidadosamente, y se resuspendió el sedimento a la concentración final de 1x107 esporas por 100 l de PBS.
4. Para la infección, 100 l de solución de esporas se aplica por vía intratraqueal en ratones hembra (C57/BL6, 8-10 semanas de edad, Harlan, Alemania). Si los neutrófilos se observa, así, el uso de Lys-EGFP ratones, llevando EGFP bajo el promotor lisozima ¹ se recomienda. Comience por anestesiar al animal con una única inyección ip de 150 l ketamina / Rompun solución (INRESA Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemania (ketamina) y Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania (Rompun), 1 ml de ketamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril de NaCl [0,9%]). 5 minutos más tarde el ratón anestesiado se puede solucionar con una banda elástica de sus dientes a la rampa (es decir, una superficie inclinada) para facilitar la intubación (figura suplementaria 1). Con unas pinzas, la lengua es empujada hacia un lado y un catéter venoso 22G (B. Braun AG, Melsungen, Alemania, Vasofix Braunüle) puede ser insertado al interior de la tráquea con una iluminación permanente con una lámpara de cuello de ganso. El éxito de la inserción del catéter se verifica al observar el movimiento regular del tórax del animal con la frecuencia de la ventilación mecánica. Cuando la intubación exitosa ha sido confirmada, 100 l suspensión de esporas se aplica mediante una micropipeta 100 microlitros. Este volumen debe ser inhalado por el animal sin ningún tipo de ayuda adicional en 2.1 s. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del animal infectado durante 2 minutos con un respirador de pequeños animales (MiniVent, Hugo Sachs, de marzo de Hugstetten, Alemania) a una velocidad de 250 respiraciones por minuto y un volumen de inhalación de 300 l por aire (figura complementaria 2). Después de la infección los animales son devueltos a su jaula y observar cada 5 minutos hasta que de nuevo ambulatorio. Los ratones no muestran ninguna evidencia de dolor o malestar durante el período de incubación siguientes.

2. Preparación de pulmón

1. 7 h después de la infección con las esporas, el animal es sacrificado por una sobredosis de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemania) hasta que los movimientos y la respiración han cesado desde hace más de 30 segundos. Esto es seguido por la toracotomía como un método secundario para asegurar la muerte clínica y permitir la visualización y el acceso de la tráquea y los pulmones. A continuación, el pecho se abrió cuidadosamente para exponer el pulmón y el tracto respiratorio superior. Luego, otro catéter venoso 22G se inserta en la tráquea a partir de la epiglotis expuestos. A través de este túbulo los pulmones se llenan de 1 ml previamente calentada bajo punto de fusión de agarosa (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemania), utilizando una jeringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Tan pronto como los pulmones se llenan de la tráquea se ata con un trozo de hilo de coser y todo el animal se coloca en un refrigerador a 4 ° C.
2. 15 minutos más tarde, cuando la agarosa se ha solidificado, todo el pulmón se extirpa a partir de la tráquea. Con un par de tijeras con punta afilada, el lóbulo del pulmón derecho se retira posteriormente, la superficie inferior secar brevemente en una hoja de papel de seda y luego el lóbulo entero está pegado a la preparación de bloques de un vibratome Vibroslice (Campden Instruments, Reino Unido, 752M ) con una gota de adhesivo tisular para la fijación (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania, Roti-Coll 1). Después de 1 min del bloque se ha instalado en la cámara de corte de la vibratome, que está lleno de pre-frío (4 ° C) PBS. El vibratome está en una vibración de gama media (5 de 10 max.) Y también una velocidad moderada (5 de 10 max.) De tal manera que una sección horizontal de lapulmonar se produce. La mitad superior del órgano se transfiere en una pequeña placa de Petri de plástico (5 cm de diámetro) donde se invierte y se fija con una arandela plana hecho a sí mismo (1 cm de diámetro interior), que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo, cada una de 1 mm de distancia (figura complementaria 3). Por último, la placa de Petri se llena con 10 ml de PBS suplementado con 10 l de ADN tinte Sytox naranja [5 mm] (Invitrogen, Alemania), resultando en una concentración final tinte de 5 micras.

3. 2-fotón láser microscopía

1. La placa de Petri que contiene la muestra de pulmón se instala en el objetivo del microscopio para que el tampón puede ser calentado a 37 ° C por un sensor de temperatura controlada calentador (figura complementaria 4). 2-fotón microscopía A continuación se lleva a cabo sobre la superficie de corte general con un microscopio Zeiss LSM 710 NLO en un escenario vertical Axio forense equipado con un lente de agua 20xNA1.0 inmersión (Zeiss, Jena, Alemania). Para las imágenes, las diferentes áreas a lo largo de la sección se analizan hasta una profundidad de 400 m con una longitud de onda de luz de 800 nm para detectar verde (530 nm) y rojo (580 nm) de fluorescencia, así como la generación de segundo armónico (SHG)-de la señal y la azul calcofluor fluorescencia (en nm de emisión 400-470) con detectores externos no descanned (NDD). Además de imágenes 2-D y las películas de lapso de tiempo (1 imagen cada 5-10 segundos), única o repetitiva de 3 dimensiones pilas de imagen puede ser entregado después de las representaciones voxel o solo las imágenes se enfocan extendida o 4-D de datos (en 3D a través del tiempo), utilizando diferentes paquetes de software. Esta configuración permite la observación microscópica del comportamiento celular en un ambiente casi intacto que, puesto que constituye la puerta de entrada para una variedad de patógenos de transmisión aérea, es de importancia inmunológica enorme. La motilidad celular, la fagocitosis y la producción neta de los neutrófilos después de la infección endógena con el hongo Aspergillus fumigatus puede ser fácilmente investigado bajo estas condiciones in situ.

4. Resultados representante

Si se realiza correctamente la imagen va a generar 2 - o 3-color diapositivas o películas. A pesar de colorante se realiza en un procedimiento de post-proceso y por tanto libremente adaptable, por lo general, seleccionar un esquema de colores que refleja el color natural de la tinta / de la señal, la cual es detectada en el canal de relación. Por lo tanto, los tintes Sytox se muestran en rojo, los hongos, así como la señal de los grupos de autoayuda se muestra en azul y, si está presente, EGFP-etiquetados células se tiñen de verde. En el primer ejemplo (Fig. 1) la señal de los grupos de autoayuda azul representa las fibras del tejido de un pulmón no infectados y el rojo de la señal Sytox es producida por los núcleos de las células residentes de pulmón a cielo abierto por el vibratome. En el segundo ejemplo (Fig. 2) un pulmón infectado se muestra, en ambas estructuras, alveolar, así como las masas de hongos, aparecen en azul, mientras que los núcleos y los Nets se tiñen de rojo. El tercer ejemplo (Fig. 3) es de un animal de Lys-EGFP transgénicos, donde además de las estructuras de azul y rojo los neutrófilos verde también puede ser visto. La migración de neutrófilos y su fagocitosis de cada uno de los elementos fúngicos en las secuencias de lapso de tiempo se muestra en la película suplementario.

Figura 1. La aparición de un trozo de pulmón no infectadas en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón fue preparado a partir de una no infectada C57/BL6 del ratón y la imagen como se describe en el protocolo. Aquí se presentan son la señal de los grupos de autoayuda de la estructura del tejido alveolar (A), la señal Sytox de los núcleos celulares a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C). El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta el tejido fibroso en la parte inferior del pulmón rebanada en comparación con la organización claramente alveolar en las áreas activas de respiración de los pulmones de arriba.

Figura 2. La aparición de un trozo de pulmón de un animal infectado Aspergillus tipo salvaje en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de un ratón infectado C57/BL6 7 h antes con A. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (A), la señal de NET Sytox ADN, así como núcleos de las células a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C) . El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta que las áreas claramente diferenciadas de las masas de hongos, los alvéolos, y las estructuras de NET-están marcados con las letras F, A y N, respectivamente.

Figura 3. La aparición de un trozo de pulmón de una infección por Aspergillus Lys-EGFP animales en 3-color de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de ratón Lys-EGFP infectados 7 h antes conA. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (azul), la señal Sytox de los núcleos celulares y redes (rojo), así como numerosos neutrófilos (verde).

Adicional Figura 1. La fijación del ratón para la intubación. Bajo ketamina / Rompun anestesia del animal se fija con una banda elástica en los dientes con el fin de facilitar la intubación con un catéter venoso 22G.

Complementaria la figura 2. Ventilación mecánica del ratón. El ratón intubados está infectado por una aplicación informática de 1x10 ⁷ esporas se resuspendieron en 100 l de PBS. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del ratón infectado con un respirador de pequeños animales.

Complementaria la figura 3. La fijación del pulmón lóbulo. Después de la preparación del lóbulo del pulmón derecho el órgano se fija en una placa de Petri por el uso de una lavadora de laboratorio hechas plana que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo.

Adicional Figura 4. Dos fotones de imágenes de instalación. La placa de Petri que contiene el lóbulo del pulmón derecho se instala sobre una estera de calefacción bajo el microscopio de 2 fotones después de la adición del ADN tinte Sytox Orange.

Suplementario película:. Neutrófilos Los neutrófilos migran y phagocytosing elementos fúngicos en los pulmones infectados por Aspergillus como se ve por lapso de tiempo de 2 fotones microscopía de un trozo de vida de pulmón 7 h después de la infección con el hongo son elementos verdes, hongos y los grupos de autoayuda son de color azul, y los núcleos celulares como NET así como las estructuras se representan en rojo. El tiempo real del experimento se muestra en la parte inferior derecha. La barra de escala representa 50 micras. Haga clic aquí para ver el video

Discussion

En tiempo real de 2 fotones microscopía in vivo o en los órganos intactos ha adquirido gran importancia en estudios sobre la fisiología de las células inmunes en los últimos 10 años. Fue con esta técnica que los eventos importantes como la dinámica de la activación de células T en los ganglios linfáticos apareció por primera vez ^2-4. Más recientemente, los investigadores también han comenzado a analizar las funciones celulares específicas, como los primeros pasos en la generación de células efectoras en los tejidos linfáticos utilizando este método ^5.

Sin embargo, a pesar de una serie de nuevos conceptos biológicos han puesto de manifiesto con este método, todavía hay un reto importante y las preguntas para las que no hay estudios de visualización intravital se han publicado hasta el momento. Cabe destacar que esto se aplica a los pulmones de mamíferos. El aspecto interesante de este órgano, como el puerto de entrada para una gran variedad de agentes patógenos en el aire, hace que sea una de las superficies más importantes en los procesos inmunológicos que tienen lugar en el cuerpo de los mamíferos. Con cada respiración durante todo el ciclo vital, las partículas no deseadas se inhalan algunos de los cuales tienen el potencial de inducir infecciones que amenazan la vida ^6. Se explica por sí mismo que en un sitio tan sensible y en peligro de extinción a la densa red de mecanismos de defensa tiene que estar presente exhibiendo todo el repertorio de las respuestas inmunes. Por otro lado, es muy importante que la lucha inducida inmunológica contra patógenos potenciales en una "sucia", el lugar está estrechamente controlada. Reacciones exageradas del sistema inmunológico tienen un alto riesgo de dañar el propio cuerpo de forma masiva por dañar el tejido del órgano a la estimulación no específica de las acciones de las células inmunitarias ^7,8.

A la luz de estas ideas que sería muy interesante y útil tener la posibilidad de investigar el comportamiento de células en los pulmones de los mamíferos en realidad en condiciones in vivo. Sin embargo, el hecho de que un sistema hasta ahora no ha sido implementado con éxito apunta claramente a las enormes dificultades que tienen que ser resueltos en el establecimiento de un protocolo de trabajo. El reto más exigente, probablemente es la estabilidad de enfoque. El pulmón como órgano responsable de la respiración está en movimiento constante en las tres direcciones del espacio para realizar la inhalación. Esta circunstancia por sí sola causa graves problemas de imagen y se puede considerar un intravital de imágenes "pesadilla". Ya un ligero movimiento a cualquier dimensión en el espacio tiene un efecto masivo deterioro en la visión microscópica, que debe ser estable con precisión micrométrica a fin de generar imágenes significativas ^9. Dado su enfoque local por sí apretado ^10, de 2 fotones microscopía es aún más sensible a la inestabilidad de actividad, como la dislocación de una cierta estructura en el rango de sólo unos pocos micrómetros en la dirección Z es equivalente a una pérdida completa de la atención y por lo tanto un experimento fallido.

El protocolo presentado en este estudio para la observación de las células inmunes en el pulmón murino todavía no es una aplicación in vivo, sino más bien una aproximación a la situación en un pulmón funcionalmente intacto ^11. Enfoques ex vivo de linfocitos de imagen, por ejemplo, en la linfa explantados nodos, se ha demostrado que se obtienen resultados equivalentes a los verdaderos en ¹² observaciones in vivo y por lo tanto son muy relevantes ^5. El observaciones in situ en cortes de pulmón, que sólo son posibles con nuestro enfoque, tendrá lugar en un pulmón infectado poco después de la escisión. La integridad en 3D en el proceso de corte está garantizada por la matriz de agarosa, un paso esencial para permitir un proceso controlado con precisión de corte de los pulmones. A pesar de que es necesario enfriar el pulmón explantado por un período corto para permitir una solidificación de la matriz de agarosa, es posible volver a cerca de las condiciones fisiológicas de las células después del corte y el recalentamiento de los tejidos. Esto se demuestra claramente por los datos que demuestran que en estas condiciones, los neutrófilos son muy activos y exhibir todo su potencial como fagocitos ágil, que son necesarios para el despacho eficaz de una infección por Aspergillus fumigatus. Ellos patrullan el tejido pulmonar que pasa a través de las barreras epiteliales a fin de alcanzar la parte interior de los alvéolos y, además, que asuma activamente esporas de hongos 11. Un hallazgo clave de este trabajo fue la aparición de estructuras similares a las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) en el órgano Aspergillus infectados. NET son un hallazgo muy reciente de un nuevo mecanismo de defensa de los neutrófilos ^13. Sin embargo, desde su descripción inicial en 2004, el número de condiciones fisiológicas o patológicas en modelos animales o humanos, donde se ha observado este fenómeno o se carece ha sido explosivo aumento de ^{14 a 16.} Curiosamente, a pesar de tanto trabajo se ha gastado en estas estructuras por parte de grupos muy diferentes, la mayoría de los informes siguen siendo en un nivel muy descriptivo y no es muchosabe sobre el mecanismo de liberación NET y su regulación. Con nuestro protocolo hemos sido capaces por primera vez para mostrar las fibras NET en un pulmón infectado. Además, hemos podido demostrar la importancia de los neutrófilos recién reclutados, así como las estructuras moleculares de hongos para su ocurrencia o la inhibición ^11. Esto demuestra claramente el potencial de nuestro método para investigar los pasos individuales de la formación de NET con más detalle. Uno podría pensar, por ejemplo, utilizar los neutrófilos de ratones knock-out adecuado para observar su capacidad de formación de NET en los experimentos de transferencia adoptiva.

Así, aunque la observación directa de la inmigración de neutrófilos de la sangre periférica no es posible con este sistema debido a la falta de suministro de sangre después de la explantación de órganos, todavía creemos que el protocolo es un enfoque valioso y relativamente fácil de manejar que permite la proyección de imagen de pasos temprano o tarde en la defensa inmune contra las infecciones pulmonares. Esto es, por tanto, un paso importante para la investigación de este fenómeno en el pulmón de respiración de los animales vivos.