Summary

Uso de fluorescentes Imuno-Química para a detecção de Edwardsiella ictaluri Em bagre do canal ( I. punctatus) Amostras

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Aqui nós descrevemos um procedimento que permita a rotulagem de<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> Em cortes histológicos de bagre do canal<em> Ictalurus punctatus</em> Usando imunohistoquímica indireta com anticorpos monoclonais Ed9 como primária, e fluorescente FITC anticorpos rotulado como um secundário. Isso permitiu a detecção da bactéria por microscopia de fluorescência.

Abstract

Enquanto Edwardsiella ictaluri é um importante patógeno do canal catfish Ictalurus punctatus e foi descoberto há quase três décadas 1,2, até agora, a melhor do conhecimento desses autores, nenhum método foi desenvolvido para permitir a visualização em situ do bactérias em cortes histológicos.

Enquanto a localização bacteriana foi determinada in vivo em estudos anteriores usando contagem placa 3, 4 radiométrica rotulados ou bactérias bioluminescentes 5, a maioria destes estudos só foram realizados ao nível de órgãos bruto, com uma exceção 6. Esta limitação é particularmente preocupante porque E. ictaluri tem um complexo ciclo de infecção 1,7, e tem uma variedade de fatores de virulência 8,9. A complexa interação de E. ictaluri com a sua variedade é semelhante em muitos aspectos, a Salmonella typhi 10, que está na mesma família taxonômica.

Aqui nós descrevemos uma técnica que permite a detecção de bactérias usando indireta imuno-histoquímica, usando o anticorpo monoclonal Ed9 descrita por Ainsworth et al. 11.

Resumidamente, um soro de bloqueio é aplicada a inclusão em parafina os cortes histológicos para prevenir não-específicas de licitação. Então, as seções são incubadas com o anticorpo primário: E. ictaluri anticorpo monoclonal específico Ed9. Anticorpos em excesso são lavados afastado eo FITC anticorpos secundários são adicionados. Após a lavagem, as seções são montadas com um meio específico fluorescentes de montagem.

Isso permitiu a detecção de E. ictaluri in situ em cortes histológicos de tecidos bagre do canal.

Protocol

1. Desafio bacteriana Bactérias crescem durante a noite a 30 ° C em agitação caldo cérebro-coração. Parar a circulação da água nos tanques de peixe e adicione o caldo na concentração de 1 em 100 (10 ml por litro, por exemplo). Após uma hora de incubação, reinicie circulação de água nos tanques para lavar as bactérias remanescentes. 2. Amostragem Tempos de amostragem e órgãos depende do objectivo do estudo, mas em noss…

Discussion

Este protocolo de detalhes de uma técnica para a visualização em situ do bagre patógeno Edwardsiella ictaluri em cortes histológicos. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo, tais descrito.

O passo mais crítico, em nossa experiência, é a lavagem dos anticorpos, tal como descrito no passo 4.4 do presente protocolo como a lavagem insuficiente pode resultar em falso positivo.

O principal problema com interpretação dos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam reconhecer a assistência técnica da Banes Michelle, assim como Dr. Petrie-Hanson Eels, Dr. Timothy Brown e por sua assistência em desenvolvimento e realização da imuno-histoquímica. Este projeto foi financiado pelo USDA CRIS projeto # MISV-0801310 e pela Mississippi State University College of Veterinary Medicine.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Brain Infusion broth Becton Dickinson 237200
MS222 Argent Labs  
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC Southern Biotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma S-9390

References

  1. Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
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  4. Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
  5. Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
  6. Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
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  11. Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
  12. Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).

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Cite This Article
Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

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