Summary
Qui si descrive una procedura che consenta l'etichettatura dei
Abstract
Mentre Edwardsiella ictaluri è un patogeno importante canale di pesce gatto Ictalurus punctatus ed è stato scoperto quasi tre decenni fa 1,2, finora, per quanto a conoscenza di questi autori ', nessun metodo è stato sviluppato per consentire la visualizzazione in situ della batteri in sezioni istologiche.
Mentre la localizzazione batterica è stata determinata in vivo negli studi precedenti con conta piastra 3, radiometriche etichettati 4 o batteri bioluminescenti 5, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo a livello di organo lordo, con una sola eccezione 6. Questa limitazione è particolarmente preoccupante perché E. ictaluri ha un ciclo complesso infezione 1,7, ed ha una varietà di fattori di virulenza 8,9. La complessa interazione di E. ictaluri con il suo ospite è simile per molti aspetti a Salmonella typhi 10, che si trova nella stessa famiglia tassonomica.
Qui si descrive una tecnica che permette per la rilevazione di batteri utilizzando indiretto immunoistochimico utilizzando l'anticorpo monoclonale Ed9 descritto da Ainsworth et al. 11.
In breve, un siero blocco viene applicato paraffina sezioni istologiche incorporato per prevenire non specifici aspettando. Poi, le sezioni vengono incubate con l'anticorpo primario: E. ictaluri anticorpo monoclonale specifico Ed9. Anticorpi in eccesso vengono risciacquati via e la FITC anticorpi marcati secondari vengono aggiunti. Dopo il risciacquo, le sezioni sono montate con una fluorescente medio di montaggio specifiche.
Questo ha permesso per la rilevazione di E. ictaluri in situ in sezioni istologiche di tessuti pesce gatto di canale.
Protocol
1. Sfida batterica
- Crescere i batteri notte a 30 ° C in agitazione Cuore brodo cervello Infusion.
- Interrompere la circolazione dell'acqua nelle vasche di pesce e aggiungere il brodo nella concentrazione di 1 a 100 (10 ml per litro, per esempio).
- Dopo un ore di incubazione, riavviare la circolazione dell'acqua nelle vasche per scovare i batteri rimasti.
2. Campionatura
- Tempi di campionamento e gli organi dipende l'obiettivo dello studio, ma nel nostro studio, abbiamo utilizzato i seguenti punti di campionamento: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 e 175 ore dopo l'infezione .
- Ad ogni punto del tempo, eutanasia sei pesci per immersione in acqua contenente MS222 e degustare i seguenti organi (selezione degli organi campionato era basata su ciò che è noto il processo di infezione): branchie, muscoli posteriori lungo la linea laterale, intestino, milza, fegato, stomaco, cuore, rene testa, tronco e del rene.
- Su di campionamento, immediatamente carico degli organi in cassette istologiche e immergerli per due ore in 1% formalina.
- Dopo due ore di fissaggio, trasferire le cassette da formalina al 50% di etanolo, dove rimangono fino incorporamento.
- Paraffina incorporare organi durante la notte con un tessuto-Tek VIP 3000 processore tessuto (Sakura Tek, Torrance, California) e la sezione a 5 micron con una Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Sezioni deceratura
- Immergere le sezioni in una vasca piena di colorazione chiara rito per circa 5 minuti per consentire a tutti di sciogliere la cera. Sollevare il rack e drenare l'eccesso di cera solvente.
- Immergere le sezioni in un secondo contenitore di chiaro-rito per 5 minuti. Dopo alcuni usi, sostituiscono il solvente nel contenitore prima e si alternano tra i contenitori prima e la seconda.
- Immergere le sezioni in 100% di alcol per rimuovere la cera solvente.
- Immergere le sezioni in una depressione seconda alcol al 100%.
- Immergere le sezioni in una depressione del 70% di alcol.
- Immergere le sezioni in acqua corrente per rimuovere ogni traccia di alcol.
4. Tampone di preparazione
- Preparare tampone fosfato sciogliendo 8,0 g NaCl, 0,2 g di KCl, 1,15 g di Na 2 HPO 4 e 0,2 g di KH 2 PO 4 in 1 litro di acqua distillata e pH a 7,4.
- Diluire PBS a 0.9x con l'aggiunta di 900 ml di PBS a 100 ml di acqua distillata.
- Preparare il blocco del siero con l'aggiunta di 2 ml di siero di topo; 200 ul Triton X-100 e 500 BSA microlitri a 50 ml di PBS 0.9x.
- Preparare 50 mM Buffered Saline bicarbonato si prepara sciogliendo 2,1 g NaHCO 3 e 4 g di NaCl in 500 ml di H 2 O distillata e titolato a pH 8.2.
5. Immunhistochemistry
- Reidratare sezioni per immersione in PBS 0.9x.
- Incubare i vetrini per 30 minuti in blocco siero.
- Incubare le sezioni in Ed9 (diluito 1 su 100 nel siero di blocco) per due ore in una camera opaco umida a temperatura ambiente.
- Risciacquare sezioni 4 volte in PBS per 10 minuti ciascuno.
- Incubare sezioni per due ore in 50 l di anticorpo secondario (anticorpi di capra anti topo marcato con FITC; diluito 500 volte a bloccare siero) in una camera opaco umida a temperatura ambiente.
- Sciacquare le sezioni 3 volte in soluzione salina tamponata con bicarbonato.
- Sciacquare sezioni brevemente in acqua deionizzata.
6. Montaggio
- Lasciare i vetrini ad asciugare al buio per alcuni minuti.
- Montaggio viene eseguita utilizzando permafluor.
- Lasciare il mezzo di montaggio a secco, preferibilmente durante la notte, in un ambiente buio fresco.
7. Microscopio
- Sezioni istologiche sono pronti ad osservare al microscopio a fluorescenza. Nel nostro esperimento, abbiamo usato una Olympus BX51 microscopio equipaggiato con una tripla (CIC; MCA Texas-Red) filtro. Il software Picture Frame (MicroFire, Goleta, California) è stato utilizzato.
8. Rappresentante dei risultati:
Poiché l'auto-fluorescenza dei tessuti dei pesci è così alta, questi tessuti apparirà arancione sotto il Tri-filtro, comodamente fornendo uno sfondo per i batteri.
In questo contesto, l'individuo batteri FITC macchiato apparirà come puntini luminosi verdi e, a 200X la loro forma asta sarà riconoscibile (Fig. 1).
Sezioni Bad può costituire falsi positivi (a causa di un problema nella fase di risciacquo), nel qual caso un gran numero di batteri sembra essere presente uniformemente sulla slide.
Figura 1. Micrografia di un muscolo che mostra due sezioni E. ictaluri (frecce a e b) (200x).
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Figura 2. Schema generale della sperimentazione
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Discussion
Questo protocollo dettagli di una tecnica per la visualizzazione in situ del patogeno pesce gatto Edwardsiella ictaluri in sezioni istologiche. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo protocollo come descritto.
La fase più critica, nella nostra esperienza, è il risciacquo degli anticorpi, come descritto nel passaggio 4.4 del presente protocollo come il lavaggio insufficiente può portare a falsi positivi.
Il problema principale con l'interpretazione dei risultati di questa tecnica è l'auto-fluorescenza del tessuto. Tuttavia, si è riscontrato che con il Tri-filtro per lo più risolto il problema, come la stragrande maggioranza dei non-specifica fluorescenza si verificano al di fuori dello spettro verde fluorescente. Inoltre, mentre questa tecnica è molto sensibile, si può mancare di rilevare basse cariche batteriche.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza tecnica di Banes Michelle e Petrie-Hanson, Eels e il Dott. Timothy Brown, per la loro assistenza sviluppare ed eseguire il immunoistochimica. Questo progetto è stato finanziato dalla USDA CRIS progetto # MISV-0801310 e dal Mississippi State University College di Medicina Veterinaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
