Summary
Здесь мы опишем процедуру, позволяющую маркировки
Abstract
Хотя Edwardsiella ictaluri является основным возбудителем канал сома Ictalurus punctatus и было обнаружено почти три десятилетия назад 1,2, до сих пор, насколько знания этих авторов, не метод был разработан для обеспечения на месте визуализации бактерии в гистологических срезов.
Хотя бактериальный локализация была определена в естественных условиях и в предыдущих исследованиях с использованием пластин насчитывает 3, радиометрические помечены 4 или биолюминесценции бактерий 5, большинство из этих исследований были только осуществляется на грубом уровне органа, за одним исключением 6. Это ограничение имеет особое беспокойство, потому что E. ictaluri имеет сложный цикл инфекции 1,7, и она имеет целый ряд факторов вирулентности 8,9. Сложного взаимодействия E. ictaluri со своим хост во многом сходны с сальмонеллы брюшного тифа 10, который находится в той же семье таксономических.
Здесь мы опишем метод позволяет для обнаружения бактерий с использованием косвенных иммуно-гистохимии использованием моноклональных антител Ed9 описывается Эйнсворт и соавт. 11.
Коротко, блокирование сыворотки наносят на парафин гистологических срезов для предотвращения неспецифического выжидал. Затем, разделы инкубировали с первичными антителами: Е. ictaluri специфических моноклональных антител Ed9. Превышение антитела смыть и FITC меченых вторичных антител добавлены. После полоскания, разделы монтируются с люминесцентными конкретные установки среды.
Это позволило обнаружения E. ictaluri на месте в гистологических срезов тканей канал сома.
Protocol
1. Бактериальные вызов
- Рост бактерий в течение ночи при 30 ° С в пожимая Мозг Сердце Инфузионные бульон.
- Стоп циркуляции воды в аквариумах и добавить бульон в концентрации 1 в 100 (10 мл на литр, например).
- После одного часа инкубации, перезагрузите циркуляции воды в резервуарах, чтобы избавиться от оставшихся бактерий.
2. Отбор проб
- Выборка раз и органов зависит от цели исследования, но в нашем исследовании мы использовали следующие точках отбора проб: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 и 175 часов после заражения .
- В каждый момент времени точки, эвтаназии шесть рыбы путем погружения в воду, содержащую MS222 и образцы следующих органов (отбор проб органов было основано на том, что известно о инфекционного процесса): жабры, задние мышцы вдоль боковой линии, кишечник, селезенка, печень, желудок, сердце, почки голову, и туловище почек.
- После отбора проб, немедленно загрузить органов в гистологических кассет и погружают их в течение двух часов в 1% формалина.
- После двух часов фиксация, передача кассет с формалина на 50% этанола, где они остаются до вложение.
- Парафин вставлять органов ночь использованием ткани-Tek VIP 3000 ткани процессор (Сакура Tek, Торранс, Калифорния) и в разделе 5 мкм использовании Leica RM2255 микротон (Leica Microsystems, Bannockburn, штат Иллинойс).
3. Депарафинизация разделы
- Погрузите разделы окрашивания корыта заполнен ясно обряда в течение примерно 5 минут, чтобы для всех воск для растворения. Поднимите стойку и слейте излишки воска растворителя.
- Погрузите разделы второй контейнер четких обряда в течение 5 минут. После нескольких использований, заменить растворитель в первый контейнер, и переключаться между первым и вторым контейнерами.
- Погрузите разделы в 100%-ным спиртом для удаления воска растворителя.
- Погрузите разделы второго корыто из 100% спирта.
- Погрузите секций в корыто 70% спирта.
- Погрузите секций в проточной воде, чтобы удалить все следы алкоголя.
4. Буфер подготовки
- Подготовка фосфатным буферным солевым раствором, растворяя 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,15 г Na 2 HPO 4 и 0,2 г KH 2 PO 4 в 1 литре дистиллированной воды и рН до 7,4.
- Развести PBS в 0.9x, добавив 900 мл PBS до 100 мл дистиллированной воды.
- Подготовка блокирование сыворотке, добавив 2 мл сыворотки мыши; 200 мкл Triton-X 100 и 500 мкл BSA в 50 мл 0,9 x PBS.
- Подготовка 50 мМ бикарбоната буферный солевой раствор готовят путем растворения 2,1 г NaHCO 3 и 4 г NaCl в 500 мл дистиллированной H 2 O и титруют до рН 8,2.
5. Immunhistochemistry
- Увлажняет разделов путем погружения в 0,9 x PBS.
- Инкубируйте слайды в течение 30 минут в блокировании сыворотки.
- Инкубируйте разделы Ed9 (разбавленный 1 из 100 в блокировании сыворотка) в течение двух часов в непрозрачной влажной камере при комнатной температуре.
- Промыть разделах 4 раза в PBS в течение 10 минут каждый.
- Инкубируйте разделы в течение двух часов в 50 мкл вторичных антител (козьи антитела мыши ФИТЦ меченые антитела, разбавленного в 500 раз в блокировании сыворотка) в непрозрачных влажной камере при комнатной температуре.
- Промыть разделах 3 раза в бикарбонат солевой буфер.
- Промыть разделах кратко в деионизованной воде.
6. Монтаж
- Оставьте слайды в сухом в темноте в течение нескольких минут.
- Монтаж осуществляется с помощью permafluor.
- Оставьте монтажа средних сухие, преимущественно ночью, в темном прохладном окружающей среды.
7. Микроскоп
- Гистологические срезы готовы наблюдать под флуоресцентным микроскопом. В нашем эксперименте мы использовали Olympus BX51 Микроскоп оснащен тройка (FITC; MCA Техас-красный) фильтр. Программное обеспечение Picture Frame (MicroFire, Goleta, Калифорния) был использован.
8. Представитель Результаты:
Поскольку авто-флуоресценции тканях рыб настолько высока, эти ткани будут появляться оранжевые под Tri-фильтр, который удобно предоставления фон для бактерий.
На этом фоне отдельные FITC окрашенных бактерий появится как ярко-зеленые точки и, по крайней 200X их стержень форма будет узнаваем (рис. 1).
Плохо разделы могут составлять ложных срабатываний (в связи с проблемой в промывки фазы), и в этом случае большое количество бактерий окажется настоящим равномерно на слайде.
Рисунок 1. Микрофотография мышц разделов с изображением двух E. ictaluri (стрелки и б) (200x).
Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Общая схема эксперимента
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол подробностей методики на месте визуализации сома возбудителя Edwardsiella ictaluri в гистологических срезов. Насколько нам известно, это первый такой протокол, описанный.
Наиболее важным шагом, по нашему опыту, является полоскание антител, как описано в шаге 4.4 настоящего протокола, недостаточное мытье может привести к ложным положительным.
Основная проблема интерпретации результатов данного метода заключается в авто-флуоресценции ткани. Тем не менее, было установлено, что с помощью Tri-фильтр главным образом решил эту проблему, так как подавляющее большинство неспецифической флюоресценции происходят за пределами зеленого флуоресцентного спектра. Кроме того, хотя этот метод весьма чувствительна, она может не обнаружить микроорганизмами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы признают, технической помощи Бэйнс Мишель, а также доктор Петра-Хансона, доктор Eels и Тимоти Браун за помощь разработке и осуществлении иммуногистохимии. Этот проект был профинансирован Министерством сельского хозяйства США КРИС проект № MISV-0801310 и Университета штата Миссисипи колледжа ветеринарной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
