Summary
Nous décrivons ici une procédure permettant à l'étiquetage des
Abstract
Bien Edwardsiella ictaluri est un pathogène majeur des barbue de rivière Ictalurus punctatus et a été découvert près de trois décennies 1,2, jusqu'à présent, à la connaissance de ces auteurs, aucune méthode n'a été développée pour permettre la visualisation in situ de la bactéries dans les coupes histologiques.
Alors que la localisation bactérienne a été déterminée in vivo dans des études précédentes utilisant un décompte plaque 3, 4 radiométrique étiquetés ou bactéries bioluminescentes 5, la plupart de ces études ont été menées uniquement au niveau des organes brut, avec une exception 6. Cette limitation est particulièrement préoccupante car E. ictaluri a un cycle d'infection complexes 1,7, et il a une variété de facteurs de virulence 8,9. L'interaction complexe de E. ictaluri avec son hôte est similaire à bien des égards à Salmonella typhi 10, qui est dans la même famille taxonomique.
Nous décrivons ici une technique permettant la détection de bactéries à l'aide indirecte d'immuno-histochimie en utilisant l'anticorps monoclonal ED9 d'anticorps décrits par Ainsworth et al. 11.
En bref, un sérum de blocage est appliqué à paraffine coupes histologiques pour empêcher les non-spécifiques Biding. Ensuite, les coupes sont incubées avec l'anticorps primaire: E. ictaluri anticorps monoclonal spécifique ED9. Anticorps en excès sont rincés et les anticorps marqués FITC secondaire sont ajoutés. Après rinçage, les sections sont montées avec un milieu de montage spécifiques fluorescents.
Cela a permis la détection de E. ictaluri in situ dans des coupes histologiques de tissus barbue de rivière.
Protocol
1. Challenge bactérien
- Cultivez bactéries nuit à 30 ° C en secouant le bouillon Brain Heart Infusion.
- Arrêtez de circulation d'eau dans les réservoirs de poissons et ajouter le bouillon de la concentration de 1 sur 100 (10 ml par litre, par exemple).
- Après une incubation d'une heure, redémarrez circulation de l'eau dans les réservoirs de débusquer les bactéries restantes.
2. Échantillonnage
- Les temps d'échantillonnage et des organes dépend de l'objectif de l'étude, mais dans notre étude, nous avons utilisé les points de prélèvement suivants: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 et 175 heures post-infection .
- A chaque point du temps, euthanasier six poissons par immersion dans de l'eau contenant MS222 et déguster les organes suivants (sélection des organes prélevés était basée sur ce qui est connu du processus de l'infection): branchies, muscles postérieurs le long de la ligne latérale, de l'intestin, la rate, foie, estomac, coeur, rein tête, et les reins du tronc.
- Après l'échantillonnage, charger immédiatement les organes dans des cassettes histologiques et les immerger pendant deux heures dans 1% de formol.
- Après deux heures de fixation, le transfert des cassettes du formol à 50% d'éthanol, où ils demeurent jusqu'à incorporation.
- Paraffine intégrer organes nuit à l'aide d'un processeur Tissue-Tek VIP tissus 3000 (Sakura Tek, Torrance, Californie) et l'article 5 um à l'aide d'un microtome Leica RM2255 (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Sections de déparaffinage
- Immerger les sections dans une auge remplie de taches claires-rite pendant environ 5 minutes pour permettre à tous de la cire à se dissoudre. Soulevez la grille et drainer l'excès de cire solvant.
- Immerger les sections dans un deuxième contenant des clairs-rite pendant 5 minutes. Après quelques utilisations, de remplacer le solvant dans le premier récipient et alternent entre les premier et second récipients.
- Immerger les sections dans l'alcool à 100% pour enlever la cire solvant.
- Immerger les sections dans une auge secondes d'alcool à 100%.
- Immerger les sections dans un creux de 70% d'alcool.
- Immerger les sections à l'eau courante pour enlever toute trace d'alcool.
4. Préparation de tampons
- Préparer tampon phosphate salin en dissolvant 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,15 g de Na 2 HPO 4 et 0,2 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre d'eau distillée et le pH à 7,4.
- Diluer PBS à 0.9x en ajoutant 900 ml de PBS à 100 ml d'eau distillée.
- Préparer le blocage du sérum en ajoutant 2 ml de sérum de souris; 200 pi de Triton-X 100 et 500 BSA ul à 50 ml de PBS 0.9x.
- Préparer 50 mM tampon bicarbonate Saline est préparée en dissolvant 2,1 g de NaHCO 3 et 4 g de NaCl dans 500 ml d'eau distillée H 2 O et titrée à pH 8,2.
5. Immunhistochemistry
- Réhydrater sections par immersion dans de 0.9x PBS.
- Incuber les lames pendant 30 minutes dans le blocage de sérum.
- Incuber sections dans ED9 (diluée au 1 100 dans le sérum de blocage) pendant deux heures dans une chambre humide, opaque, à la température ambiante.
- Rincez les articles 4 fois dans du PBS pendant 10 minutes chacun.
- Incuber sections pendant deux heures dans 50 ul de l'anticorps secondaire (anticorps de chèvre anti-souris FITC étiqueté; diluée 500 fois dans le blocage de sérum) dans une chambre humide, opaque, à la température ambiante.
- Rincer les sections 3 fois dans du bicarbonate de solution saline tamponnée.
- Rincer brièvement dans les sections de l'eau déminéralisée.
6. Montage
- Laisser les lames sécher dans l'obscurité pendant quelques minutes.
- Le montage est effectué en utilisant permafluor.
- Laisser le milieu de montage à sec, de préférence la nuit, dans un environnement sombre et frais.
7. Microscope
- Des coupes histologiques sont prêts à observer sous un microscope à fluorescence. Dans notre expérience, nous avons utilisé un Olympus BX51 microscope équipé d'un triplet (FITC; MCA Texas Red) filtre. Le logiciel Picture Frame (MicroFire, Goleta, Californie) a été utilisé.
8. Les résultats représentatifs:
Parce que l'auto-fluorescence des tissus du poisson est si élevé, ces tissus apparaîtra orange sous le Tri-filtre, idéalement fournir un fond pour les bactéries.
Dans ce contexte, l'individu FITC bactéries teinté apparaîtra aussi brillant points verts et, à leur forme 200X tige sera reconnaissable (figure 1).
Bad sections peuvent constituer de faux positifs (en raison d'un problème dans la phase de rinçage), auquel cas un grand nombre de bactéries semblent être présents de manière uniforme sur la diapositive.
Figure 1. Micrographie d'une des sections musculaires montrant deux E. ictaluri (flèches a et b) (200x).
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Figure 2. Diagramme d'ensemble de l'expérience
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Discussion
Ce protocole décrit une technique pour la visualisation in situ de l'silure pathogène Edwardsiella ictaluri dans les coupes histologiques. Pour le meilleur de notre connaissance, c'est le premier protocole décrit par exemple.
L'étape la plus critique, dans notre expérience, est le rinçage de l'anticorps tel que décrit dans l'étape 4.4 du présent protocole comme le lavage insuffisant peut entraîner des faux positifs.
Le principal problème avec l'interprétation des résultats de cette technique est l'auto-fluorescence des tissus. Toutefois, on a constaté que l'utilisation du Tri-filtre essentiellement résolu ce problème tant que la vaste majorité de la fluorescence non-spécifique se produisent en dehors du spectre de fluorescence verte. Aussi, tandis que cette technique est très sensible, il peut ne pas détecter de faibles charges bactériennes.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner l'aide technique de Banes Michelle ainsi que le Dr Petrie-Hanson, Eels Dr et Timothy Brown pour leur aide en développement et l'exécution des immunohistochimie. Ce projet a été financé par l'USDA CRIS projet # MISV-0801310 et par la Mississippi State University College de Médecine Vétérinaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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