Summary
Burada etiketleme olanak sağlayan bir prosedür
Abstract
Kanal kedibalığı Ictalurus punctatus önemli bir patojen Edwardsiella ictaluri ve yaklaşık üç yıl 1,2 önce keşfetmiş oldu ederken, şimdiye kadar, bu yazarların bilgi en iyi, hiçbir yöntem in situ görselleştirme izin vermek için geliştirilmiş oldu histolojik kesitlerde bakteri.
Plaka sayıları 3, radyometrik etiketli 4, ya da bioluminescent bakteri 5 kullanarak önceki çalışmalar in vivo bakteriyel yerelleştirme belirlenecek olsa da, bu çalışmaların çoğu sadece bir istisna dışında 6 ile brüt organ seviyesinde olmuştur . Bu sınırlama özellikle endişe vericidir, çünkü E. ictaluri karmaşık bir enfeksiyon döngüsü 1,7 ve 8,9 virülans faktörleri bir çeşitlilik vardır. E. karmaşık bir etkileşim ictaluri, ev sahibi ile, aynı taksonomik aile içinde Salmonella typhi 10, birçok bakımdan benzer .
Burada Ainsworth ve ark tarafından tanımlanan monoklonal antikor Ed9 kullanarak dolaylı immün histokimya 11 kullanılarak bakterilerin tespiti için izin veren bir tekniktir .
Kısaca, engelleyici bir serum non-spesifik biding önlemek için parafin histolojik kesitlerde uygulanır. E.: Daha sonra, bölümleri birincil antikor ile inkübe edilir ictaluri spesifik monoklonal antikor Ed9. Aşırı antikorlar durulanır ve FITC etiketli sekonder antikor eklenir. Durulandıktan sonra, bir floresan özel montaj orta bölümleri ile monte edilir.
Bu tespiti E. için izin kanal kedibalığı dokuların histolojik kesitlerde in situ ictaluri.
Protocol
1. Bakteriyel meydan okuma
- 30 bakteri gecede büyütün ° C Beyin Kalp İnfüzyon suyu sallayarak.
- Balık tanklarında su sirkülasyonu durdurun ve 100 1 konsantrasyonu (Örneğin, litre başına 10 ml) suyu ekleyin.
- Bir saat inkübasyondan sonra, tanklarda kalan bakterilerin dışarı atılması için su sirkülasyonu yeniden başlatın.
2. Örnekleme
- Örnekleme zamanları ve organları çalışmanın amacı bağlıdır ama bizim çalışmamızda, aşağıdaki örnekleme noktaları: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 ve 175 saat sonrası enfeksiyon .
- Solungaçları, lateral hat, bağırsak, dalak boyunca arka kasları, her zaman noktalarında, MS222 ve örnek aşağıdaki organlar (örneklenmiş organlarının seçimi enfeksiyon sürecinin bilinen dayalı) içeren suya daldırma altı balık euthanize karaciğer, mide, kalp, kafa böbrek, ve gövde böbrek.
- Örnekleme üzerine, histolojik kasetleri organları hemen yük ve% 1 formalin iki saat onları batırmak.
- Gömme kadar kalır fiksasyon iki saat sonra, formalin,% 50 etanol kasetleri aktarmak.
- Parafin gecede doku Tek VIP 3000 doku işlemci (Sakura Tek, Torrance, California) ve Leica RM2255 mikroton (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois) kullanılarak 5μm bölümü kullanarak organları gömün.
3. Dewaxing bölümleri
- Çözmek için tüm balmumu izin yaklaşık 5 dakika boyunca net tören ile dolu bir boyama çukurda bölümlerde bırakın. Rafa kaldırın ve aşırı balmumu çözücü boşaltın.
- 5 dakika boyunca net ayin ikinci bir kapta bölümlerde bırakın. Birkaç kullanımdan sonra, birinci ve ikinci konteyner arasındaki ilk konteyner ve alternatif solvent değiştirin.
- Balmumu çözücü kaldırmak için% 100 alkol bölümlerde bırakın.
- % 100 alkol ikinci bir çukurda bölümlerde bırakın.
- % 70 alkol çukur bölümler bırakın.
- Musluk suyu, alkol bütün izlerini kaldırmak için çalışan bölümlerde bırakın.
4. Tampon hazırlık
- Fosfat 7.4, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 ve 0.2 g KH 2 PO 4, distile su ve pH 1 litre içine eriterek tamponlu salin hazırlayın.
- 0.9X için PBS PBS 900 ml, 100 ml distile su ekleyerek sulandırınız.
- Engelleme, 2 ml fare serumu ekleyerek serum hazırlayın; 200 ul Triton-X 100 ve 500 ul BSA 0.9X PBS 50 ml.
- 50 mM Bikarbonat Tamponlanmış Tuzlu 2.1 500 ml saf H 2 O g NaHCO 3 ve 4 g NaCl erime ve pH 8.2 'ye titre tarafından hazırlanan hazırlayın.
5. Immunhistokimyasal
- 0.9X PBS daldırma bölümleri rehidrate.
- Slaytlar serum engelleme 30 dakika inkübe edin.
- Oda sıcaklığında opak bir nemli odasında iki saat boyunca Ed9 (engelleme serum 100 1 seyreltilmiş) bölümleri inkübe edin.
- Her biri için 10 dakikalık bölümler PBS içinde 4 kez durulayın.
- Oda sıcaklığında opak bir nemli odasında ikincil antikor 50 ul (serum engelleme 500 kez sulandırılmış keçi anti fare FITC etiketli antikorlar) bölümlerde iki saat süreyle inkübe edin.
- Bikarbonat içinde 3 kez tamponlu salin bölümleri durulayın.
- Deiyonize su kısaca bölümleri durulayın.
6. Montaj
- Slaytları, bir kaç dakika karanlığa kurumaya bırakın.
- Montaj permafluor kullanılarak yapılır.
- Montaj orta, tercihen bir gece, karanlık ve serin bir ortamda kuruması için bırakın.
7. Mikroskop
- Histolojik bölümler floresan mikroskop altında gözlemlemek için hazır. Filtresi; deneyde, biz üçlü (MCA Texas-Kırmızı FITC) ile donatılmış bir Olympus BX51 mikroskop kullanıldı. Resim Çerçevesi yazılımı (MicroFire, Santa Barbara, Kaliforniya) kullanılmıştır.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Balık dokuların otomatik floresan çok yüksek olduğundan, bu dokulardaki bakteriler için elverişli bir arka plan sağlayarak, Tri-filtre altında turuncu görünecektir.
Bu çerçevede, bireysel FITC lekeli bakteri parlak yeşil nokta olarak görünecek ve 200X kendi çubuk şekli tanınabilir olacaktır (Şekil 1).
Kötü bölümlerde çok sayıda bakteri düzgün slayt mevcut gibi görünen bu durumda, durulama aşamasında bir sorun nedeniyle yanlış pozitif oluşturabilirler.
Şekil 1'de iki E. gösteren bir kas bölümden Mikrografik ictaluri (oklar, a ve b) (200x).
igure 2 "/>
Şekil 2 deney genel şeması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, histolojik kesitlerde kedibalığı patojen Edwardsiella ictaluri yerinde görselleştirme için kullanılan bir tekniktir. Bizim bilgilerimize göre en iyi şekilde, bu açıklanan ilk böyle bir protokol.
En kritik adım, deneyimlerimiz, yanlış pozitif yol açabilir yetersiz yıkama gibi mevcut protokol adım 4.4 'de anlatıldığı gibi antikorların durulama.
, Bu tekniğin sonuçları yorumlama temel sorun doku otomatik floresan. Ancak, non-spesifik floresan büyük çoğunluğu Üç filtre çoğu çözüldü bu sorunu kullanarak yeşil floresan spektrum dışında ortaya bulundu. Ayrıca, bu teknik oldukça duyarlı iken, gazinolarda algılamak için başarısız olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Michelle Banes teknik yardımın yanı sıra Dr. Petrie-Hanson, Dr. Eels ve Timothy Brown, onların yardım ve immünohistokimya performans tanımak istiyoruz. Bu proje, ABD Tarım Bakanlığı CRIS proje # MISV-0801310 ve Veteriner Mississippi State University College tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
