Summary
Aqui nós descrevemos um procedimento que permita a rotulagem de
Abstract
Enquanto Edwardsiella ictaluri é um importante patógeno do canal catfish Ictalurus punctatus e foi descoberto há quase três décadas 1,2, até agora, a melhor do conhecimento desses autores, nenhum método foi desenvolvido para permitir a visualização em situ do bactérias em cortes histológicos.
Enquanto a localização bacteriana foi determinada in vivo em estudos anteriores usando contagem placa 3, 4 radiométrica rotulados ou bactérias bioluminescentes 5, a maioria destes estudos só foram realizados ao nível de órgãos bruto, com uma exceção 6. Esta limitação é particularmente preocupante porque E. ictaluri tem um complexo ciclo de infecção 1,7, e tem uma variedade de fatores de virulência 8,9. A complexa interação de E. ictaluri com a sua variedade é semelhante em muitos aspectos, a Salmonella typhi 10, que está na mesma família taxonômica.
Aqui nós descrevemos uma técnica que permite a detecção de bactérias usando indireta imuno-histoquímica, usando o anticorpo monoclonal Ed9 descrita por Ainsworth et al. 11.
Resumidamente, um soro de bloqueio é aplicada a inclusão em parafina os cortes histológicos para prevenir não-específicas de licitação. Então, as seções são incubadas com o anticorpo primário: E. ictaluri anticorpo monoclonal específico Ed9. Anticorpos em excesso são lavados afastado eo FITC anticorpos secundários são adicionados. Após a lavagem, as seções são montadas com um meio específico fluorescentes de montagem.
Isso permitiu a detecção de E. ictaluri in situ em cortes histológicos de tecidos bagre do canal.
Protocol
1. Desafio bacteriana
- Bactérias crescem durante a noite a 30 ° C em agitação caldo cérebro-coração.
- Parar a circulação da água nos tanques de peixe e adicione o caldo na concentração de 1 em 100 (10 ml por litro, por exemplo).
- Após uma hora de incubação, reinicie circulação de água nos tanques para lavar as bactérias remanescentes.
2. Amostragem
- Tempos de amostragem e órgãos depende do objectivo do estudo, mas em nosso estudo, foram utilizados os pontos de amostragem: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 e 175 horas pós-infecção .
- Pontos em cada tempo, euthanize seis peixes por imersão em água contendo MS222 e amostra os seguintes órgãos (seleção dos órgãos amostrados foi baseado no que é conhecido do processo de infecção): brânquias, músculos posteriores ao longo da linha lateral, intestino, baço, estômago, fígado, coração, rins, cabeça, tronco e rim.
- Após a amostragem, imediatamente os órgãos de carga em cassetes histológicos e mergulha-as por duas horas em 1% de formol.
- Após duas horas de fixação, a transferência das cassetes de formol a 50% de etanol, onde permanecem até a incorporação.
- Parafina incorporar órgãos durante a noite usando um lenço de papel-Tek VIP processador de tecido 3000 (Sakura Tek, Torrance, Califórnia) e na seção de 5m usando uma Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Seções desparafinação
- Mergulhe as seções em um cocho cheio de coloração clara de rito para cerca de 5 minutos para permitir toda a cera para dissolver. Levante a prateleira e drenar o excesso de cera solvente.
- Mergulhe as seções em um segundo recipiente de clara de rito por 5 minutos. Depois de alguns usos, substituir o solvente no recipiente de primeira e alternar entre os recipientes de primeiro e segundo.
- Mergulhe as seções em álcool 100% para remover a cera solvente.
- Mergulhe as seções em um cocho de segundo de álcool a 100%.
- Mergulhe as seções em uma calha de álcool 70%.
- Mergulhe as seções em água corrente para remover todos os vestígios de álcool.
4. Preparação de tampão
- Prepare tampão fosfato salina por dissolução de 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 e 0,2 g KH 2 PO 4 em 1 litro de água destilada e pH para 7,4.
- Diluir PBS para 0.9x, adicionando 900 ml de PBS e 100 ml de água destilada.
- Prepare bloqueio soro adicionando 2 ml de soro do mouse; 200 mL Triton X-100 e 500 mL BSA a 50 ml de 0.9x PBS.
- Prepare 50 mM Buffered Saline Bicarbonato é preparada dissolvendo 2,1 g NaHCO 3 e 4 g de NaCl em 500 ml H 2 O destilada e titulada até pH 8.2.
5. Immunhistochemistry
- Reidratar seções por imersão em 0.9x PBS.
- Incubar as lâminas por 30 minutos no bloqueio de soro.
- Incubar seções Ed9 (diluída 1 em 100 no soro bloqueio) por duas horas em uma câmara úmida opaca à temperatura ambiente.
- Enxágüe seções 4 vezes em PBS por 10 minutos cada.
- Incubar seções por duas horas em 50 ul do anticorpo secundário (cabra anticorpos anti rato FITC; diluídas 500 vezes no bloqueio de soro) em uma câmara úmida opaca à temperatura ambiente.
- Enxágüe seções 3 vezes em solução salina de bicarbonato.
- Enxágüe seções brevemente em água deionizada.
6. Montagem
- Deixe os slides para secar na escuridão por alguns minutos.
- A montagem é realizada utilizando permafluor.
- Deixar o meio de montagem para secar, preferencialmente durante a noite, em um ambiente escuro e fresco.
7. Microscópio
- Cortes histológicos estão prontos para observar em um microscópio fluorescente. Em nosso experimento, usamos uma Olympus BX51 microscópio equipado com um triplo (FITC; MCA-Texas Red) filtro. O software Picture Frame (MicroFire, Goleta, Califórnia) foi utilizado.
8. Resultados representativos:
Porque a auto-fluorescência de tecidos de peixes é tão alta, estes tecidos aparecerá laranja sob o Tri-filtro, convenientemente fornecendo um fundo para as bactérias.
Neste contexto, o indivíduo FITC bactérias coradas vai aparecer como pontos verdes brilhantes e, ao 200X sua forma vara será reconhecível (Fig. 1).
Seções ruim pode constituir falsos positivos (devido a um problema na fase de enxaguamento), caso em que um grande número de bactérias parecem estar presentes de maneira uniforme no slide.
Figura 1. Micrografia de um músculo mostrando duas seções E. ictaluri (setas a e b) (200x).
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Figura 2. Esquema geral do experimento
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Discussion
Este protocolo de detalhes de uma técnica para a visualização em situ do bagre patógeno Edwardsiella ictaluri em cortes histológicos. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo, tais descrito.
O passo mais crítico, em nossa experiência, é a lavagem dos anticorpos, tal como descrito no passo 4.4 do presente protocolo como a lavagem insuficiente pode resultar em falso positivo.
O principal problema com interpretação dos resultados desta técnica é a auto-fluorescência do tecido. No entanto, verificou-se que a utilização do Tri-filtro em sua maioria resolvido problema que como a grande maioria da fluorescência não-específica ocorrem fora do espectro verde fluorescente. Além disso, enquanto esta técnica é bastante sensível, pode falhar na detecção de baixas cargas bacterianas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer a assistência técnica da Banes Michelle, assim como Dr. Petrie-Hanson Eels, Dr. Timothy Brown e por sua assistência em desenvolvimento e realização da imuno-histoquímica. Este projeto foi financiado pelo USDA CRIS projeto # MISV-0801310 e pela Mississippi State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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