Summary
A continuación se describe un procedimiento que permita el etiquetado de los
Abstract
Mientras Edwardsiella ictaluri es un importante patógeno de bagre de canal Ictalurus punctatus y se ha descubierto hace casi tres décadas 1,2, hasta ahora, a lo mejor del conocimiento de estos autores, no existe ningún método ha sido desarrollado para permitir la visualización en situ de la las bacterias en los cortes histológicos.
Mientras que la localización de bacterias se ha determinado in vivo en los estudios previos con el conteo de placas 3, 4 radiométricas etiquetados, o bacterias bioluminiscentes 5, la mayoría de estos estudios se han realizado sólo en el nivel del órgano bruto, con una excepción 6. Esta limitación es particularmente preocupante debido a E. ictaluri tiene un complejo ciclo de infección de 1,7, y tiene una variedad de factores de virulencia 8,9. La compleja interacción de E. ictaluri con su huésped es similar en muchos aspectos a Salmonella typhi 10, que se encuentra en la misma familia taxonómica.
A continuación se describe una técnica que permite la detección de bacterias utilizando indirectos de inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal ED9 anticuerpos descritos por Ainsworth et al. 11.
En pocas palabras, un suero de bloqueo se aplica a los cortes histológicos embebidos en parafina para evitar que no específica vinculante. A continuación, las secciones se incuban con el anticuerpo primario: E. ictaluri anticuerpo monoclonal específico ED9. El exceso de anticuerpos se enjuaga y el FITC anticuerpos secundarios marcados se agregan. Después del lavado, las secciones se montan con un fluorescente medio específico de montaje.
Esto permitió la detección de E. ictaluri in situ en secciones histológicas de tejidos bagre de canal.
Protocol
1. Ataque bacteriano
- Crecimiento de las bacterias durante la noche a 30 ° C en agitación de cerebro y corazón de caldo de infusión.
- Detener la circulación del agua en los tanques de peces y añadir el caldo en una concentración de 1 en 100 (10 ml por litro, por ejemplo).
- Después de una hora de incubación, reinicie la circulación del agua en los tanques para eliminar las bacterias restantes.
2. Muestreo
- Tiempos de muestreo y de los órganos depende del objetivo del estudio, pero en nuestro estudio, hemos utilizado los siguientes puntos de muestreo: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 y 175 horas post-infección .
- En cada uno de los puntos de tiempo, la eutanasia a seis peces por inmersión en agua que contenga MS222 y muestra los siguientes órganos (los órganos de selección de la muestra se basó en lo que se conoce del proceso de infección): agallas, músculos posteriores a lo largo de la línea lateral, intestino, bazo, hígado, estómago, corazón, riñón cabeza, tronco y los riñones.
- En el muestreo, la carga inmediata de los órganos de casetes histológicos y sumergirlos durante dos horas en formol al 1%.
- Después de dos horas de fijación, la transferencia de las cintas de formol al 50% de etanol, donde permanecen hasta la incrustación.
- Parafina integrar los órganos durante la noche utilizando un pañuelo de papel-Tek VIP 3000 procesador de tejidos (Sakura Tek, Torrance, California) y la sección de 5μm con una Leica RM2255 microtono (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Secciones desparafinado
- Sumerja las secciones de un canal lleno de manchas claras de rito durante aproximadamente 5 minutos para permitir que toda la cera que se disuelva. Levante el bastidor y escurra el exceso de cera solvente.
- Sumerja las partes en un segundo recipiente de claro-rito por 5 minutos. Después de varios usos, sustituir el disolvente en el primer recipiente y se alternan entre los contenedores de primera y segunda.
- Sumerja las secciones en el 100% de alcohol para quitar la cera solvente.
- Sumerja las secciones de un segundo a través de 100% de alcohol.
- Sumerja las secciones de un canal de 70% de alcohol.
- Sumerja las partes con agua del grifo para eliminar todo rastro de alcohol.
4. Búfer de preparación
- Preparar tampón fosfato salino mediante la disolución de 8,0 g de NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g de Na 2 HPO 4 y 0,2 g KH 2 PO 4 en 1 litro de agua destilada y el pH a 7,4.
- Diluir PBS a 0,9 veces mediante la adición de 900 ml de PBS a 100 ml de agua destilada.
- Preparar suero de bloqueo mediante la adición de 2 ml suero de ratón, 200 l de Triton X-100 y 500 l de BSA a 50 ml de PBS 0.9x.
- Preparar 50 mM de bicarbonato de solución salina tamponada se prepara disolviendo 2,1 g de NaHCO 3 y 4 g de NaCl en 500 ml de H2O destilada y pH a 8.2.
5. Immunhistochemistry
- Rehidratar secciones por inmersión en PBS 0.9x.
- Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en suero de bloqueo.
- Incubar las secciones en ED9 (diluido 1 en 100 en el suero de bloqueo) durante dos horas en una cámara húmeda opaco a temperatura ambiente.
- Enjuague las secciones 4 veces en PBS durante 10 minutos cada uno.
- Incubar las secciones de dos horas en 50 l de la secundaria de anticuerpos (anti-ratón de cabra anticuerpos marcado con FITC, diluido 500 veces en el suero de bloqueo) en una cámara húmeda opaco a temperatura ambiente.
- Enjuague las secciones 3 veces en solución salina tamponada con bicarbonato.
- Enjuague las secciones brevemente en agua destilada.
6. Montaje
- Dejar el portaobjetos se sequen en la oscuridad durante unos minutos.
- Montaje se realiza mediante permafluor.
- Dejar el medio de montaje para secar, preferentemente durante la noche, en un ambiente fresco y oscuro.
7. Microscopio
- Los cortes histológicos están listos para observar bajo un microscopio de fluorescencia. En nuestro experimento, se utilizó un microscopio Olympus BX51 equipado con un triple (FITC, Texas-Red MCA) del filtro. El software Picture Frame (MicroFire, Goleta, California) fue utilizado.
8. Los resultados representativos:
Debido a que el auto fluorescencia de los tejidos del pez es tan alto, estos tejidos van a aparecer de color naranja en el Tri-filtro, convenientemente proporcionar un fondo para las bacterias.
En este contexto, el individuo bacterias teñidas con FITC aparecerá como brillantes puntos verdes y, en su forma de 200X varilla será reconocible (Fig 1).
Las secciones defectuosas pueden constituir falsos positivos (debido a un problema en la fase de lavado), en cuyo caso una gran cantidad de bacterias que parecen estar presentes de manera uniforme en la diapositiva.
Figura 1. Micrografía de una sección del músculo que muestra a dos E. ictaluri (flechas A y B) (200x).
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Figura 2. Esquema general del experimento
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Discussion
Este protocolo detalles de una técnica para la visualización in situ en el bagre patógeno Edwardsiella ictaluri en los cortes histológicos. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer protocolo como se describe.
El paso más crítico, en nuestra experiencia, es el lavado de los anticuerpos como se describe en el paso 4.4 del presente protocolo como el lavado insuficiente puede dar lugar a falsos positivos.
El principal problema con la interpretación de los resultados de esta técnica es la autofluorescencia de los tejidos. Sin embargo, se encontró que el uso de la Tri-filtro sobre todo resuelto ese problema, ya que la gran mayoría de la fluorescencia no específica se producen fuera del espectro de color verde fluorescente. Asimismo, si bien esta técnica es muy sensible, se puede fallar en la detección de baja carga bacteriana.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la asistencia técnica de Banes Michelle, así como el Dr. Petrie-Hanson, anguilas y el Dr. Brown Timoteo por su asistencia en el desarrollo y la realización de la inmunohistoquímica. Este proyecto fue financiado por el USDA CRIS proyecto # MISV-0801310 y por la Universidad Estatal de Mississippi Colegio de Medicina Veterinaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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