Summary
この通信は、dsDNAとタンパク質定量用BioSpec -ナノUV - VIS分光光度計の精度と再現性に関するデータを提示。自動拭き取り機能は、より正確な結果を得るために最小のキャリーオーバーのスループットと結果を改善しながらであっても、超小型のボリューム（1〜2リットル）で、再現性は、優れています。
Abstract
核酸の定量の手順は、最後の三十年で大きく進歩している。ますます、分子生物学者は、彼らの実験のための核酸サンプルの一貫性のある小容量の分析を必要とする。 BioSpec - nanoは特殊な光学系と敏感なPDA検出器を経由して現在のDNAの定量方法に固有の不正確な、非再現性の結果、、の問題に対して可能性のあるソリューションを提供します。 BioSpec - nanoはまた、それによって光ファイバー素子と手動洗浄の、退屈で反復的な、そして一貫性のない配置を排除し、取り付け、測定、および洗浄が楽器によって行われるように自動化機能を備えています。
本研究では、データはDNAとタンパク質の定量について、同様の測定再現性と精度で表示されます。自動化されたサンプルの連絡先と迅速なスキャンは、優れたスループット、その結果、3秒で測定することができます。データ解析は、ソフトウェアの組み込み機能を用いて行われる。 DNA濃度を計算するために使用される式は次のとおりです。
サンプルの濃度= DF ·（OD260 - OD320）·農協（1）
=サンプルの希釈率とNACF =核酸の濃縮係数をどこDF。
核酸濃度の係数は1を選択した分析物にしたがって設定されています。
タンパク質濃度の結果は、それぞれE280と分子量の値を入力して、μg/ mLのようまたはモル/ Lで表すことができます。チロシン、トリプトファン、システイン（SS結合）のための残留値はe280Calcタブで入力されると、吸光係数の値は、E280のように計算されている= 5500 ×（トリプトファン残基）+ 1490 ×（Tyr残基）+ 125 ×（システインSS結合） 。 E280値は、濃度計算のためのソフトウェアで使用されます。
核酸とタンパク質の濃度測定に加えて、BioSpec - nanoは、他の多くの分析対象物の超マイクロボリューム分光光度計として、あるいは5 mm光路長セルを使用して標準的な分光光度計として使用することができます。
Protocol
1。 DNAの定量のための手順
- 楽器の電源をオンにします。
- PCのデスクトップからBioSpec - nanoソフトウェアを開きます。
- シンプルな核酸二本鎖DNAのタブ（図1）をクリックしてください。
- ソフトウェアは、計測器との通信を確立し、初期化シーケンスを実行します。これは、測定器が仕様に従って実行していることを確認します。
- 光路長スライダーで0.7または0.2 mmを選択します。これは、光路長を選択し、すべての計算は、選択された光路長に基づいています。
- BioSpec - nanoソフトウェアをクリックしてセットアップ- Autowipingのセットアップの次の。 1または2を選択します。
- ピペット2μL（0.7 mm用）、H 2 Oまたは台座上にバッファ。
- ブランク測定用の空白またはF6をクリックします。新しい光路長が選択されるたびに、それは空白を記録する必要があります。
- 台座上のサンプルのピペット2μL。
- ソフトウェアのスタートや本体のスタートボタンを押してクリック。アッパーウィンドウには、サンプル液滴と接触するために移動します。キセノンフラッシュは観察することができます。
- 再現性を調べるには、同じサンプルを3回繰り返します。
- 記録されたすべてのデータが。芽のファイルとして保存されます。
- 。pdfまたは。csvファイルとして保存するには、PDF / CSVまたはF9を保存]をクリックします。結果は、[保存]タブで適切な選択を使用して。csvファイルとして保存することができます。
2。タンパク質定量のためのプロトコル
- タンパク質定量のタブを選択します（図2）。
- 既知の場合、吸光係数のE280を入力してください。
- E280が知られていない場合、それはe280Calcを使用して計算する。
- 光路長スライダーで0.7または0.2 mmを選択します。
- セットアップ- Autowipingのセットアップ]をクリックします。 2を選択するか、上記の。
- ピペット3μL（0.2 mm用）、H 2 Oまたは台座上にバッファ。
- ブランク測定用の空白またはF6をクリックします。
- 台座上のタンパク質サンプルをピペット3μL。
- ソフトウェアのスタートや本体のスタートボタンを押してクリック。
- 再現性を調べるには、同じサンプルを3回繰り返します。
- 記録されたすべてのデータが。芽のファイルとして保存されます
- 。pdfまたは。csvファイルとして保存するには、PDF / CSVまたはF9を保存]をクリックします。
3。代表的な結果：
1。 DNAの定量の結果
図3は、典型的な二本鎖DNAのサンプルの測定からデータを示しています。濃度と計算されたOD 280分の260比も表示されます。図4は、DNAの定量のための再現性のテスト結果が含まれています。図3と図4に示す結果のデータは、0.26％と低く、相対標準偏差から明らかなように、再現性の高いです。
注1：
DNAの定量が不正確には紫外領域で吸収することができるバッファー成分の存在から生じる可能性があります。また、均質な試料溶液を使用する必要があります。ピペッティングされているサンプルの量はわずか1〜2μLであるとして、あらゆる気泡の導入なしに正確な量を注意深くピペット操作が必要です。
2。タンパク質定量の結果
図5は、BSAのためのタンパク質濃度の分析を表します。 μg/ mLのタンパク質濃度は、E280の値に基づいています。図6は、再現性の分析を示しています。 DNAのためだけでなく、タンパク質のためだけではなく - それはBioSpec -ナノは正確に濃度を測定することが0.51％、相対標準偏差から明らかである。
注2：タンパク質の濃度に影響を与える要因
タンパク質の正確な濃度測定は、pH、緩衝液、温度、または添加物に起因する不安定性から最小の影響がある場合に有効です。最も精製されたタンパク質は、処理の様々なステップを通過します、従ってそれは、タンパク質が液滴の形成を妨げる可能性界面活性剤または他の添加剤を含んでいる可能性があります。そのようなサンプルについては、5 mmの光路長の石英セルを使用することを強くお勧めします。
二本鎖DNAの定量化のため図1の分析物の選択ウィンドウ
非標識タンパク質の定量については、 図2の分析物の選択ウィンドウ
DNAの定量化のための図3。代表データ
DNAの定量については、 図4。再現性のデータ
図5。タンパク質定量のための代表的なデータ
図6。タンパク質定量のための再現性のデータ
Discussion
BioSpec - nanoはこのような矛盾した結果と面倒な肉体労働のようなDNAの定量方法に固有の現在の問題を、解決するために設計されています。各測定値は、経験豊富な分子生物学者が1分間に3から6についての複数のサンプルを分析できるように、わずか3秒かかります。ユニークなワイパー機能は、測定のスループットを向上するだけでなく、測定値の間に無視できるキャリーオーバーで、その結果、台座の手動クリーニングが不要となります。さらに、1000 ng /μLのを含むDNAサンプルのためわずか2ワイプを使用してテストでは、キャリーオーバーを示した2未満ng /μLの。
5 mmの光路長のセルの可用性は、希薄な核酸や蛋白質のサンプルを分析するためのオプションを提供し、他のアプリケーションのための本器の利用を拡張します。
Disclosures
Suja Sukumaran、博士はこの記事で紹介楽器を作る島津の従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| Calf Thymus DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich |
References
- Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
