Summary
Esta comunicação apresenta dados sobre a precisão e reprodutibilidade dos BioSpec nano-espectrofotômetro UV-VIS para dsDNA e quantificação de proteínas. Mesmo com ultra-pequenos volumes (1 a 2 L), a reprodutibilidade é excelente, enquanto a função automática de limpeza melhora o rendimento e os resultados em transição mínima para resultados mais precisos.
Abstract
Procedimentos de quantificação de ácidos nucleicos têm avançado significativamente nos últimos três décadas. Cada vez mais, os biólogos moleculares exigem análise de pequeno volume consistente de amostras de ácido nucléico para seus experimentos. O BioSpec-nano oferece uma solução potencial para os problemas do impreciso, não-reprodutibilidade de resultados, inerente aos métodos de quantificação atual DNA, via óptica especializada e um detector sensível PDA. O BioSpec-nano também tem a funcionalidade automatizada, que a montagem de medição, e limpeza são feitas pelo instrumento, eliminando assim a colocação tedioso, repetitivo, e inconsistente do elemento de fibra ótica e limpeza manual.
Neste estudo, os dados são apresentados na quantificação de DNA e proteínas, bem como sobre reprodutibilidade de medição e precisão. Contato automatizada da amostra e digitalização rápida permite a medição em três segundos, resultando em rendimento excelente. A análise dos dados é realizada utilizando os recursos built-in do software. A fórmula utilizada para o cálculo da concentração de DNA é:
Concentração da amostra = DF · (OD260 OD320-) · NACF (1)
Onde DF = factor de diluição de amostra e NACF = fator de concentração de ácido nucléico.
O fator de concentração de ácido nucléico é definida de acordo com o analito seleccionados 1.
Resultados concentração de proteína pode ser expressa como mg / mL ou como moles / L, inserindo e280 e valores de peso molecular, respectivamente. Quando os valores de resíduos de Tyr, Trp e cisteína (SS bond) são inseridos no guia e280Calc, os valores do coeficiente de extinção são calculados como e280 = 5500 x (resíduos Trp) + 1,490 x (resíduos de Tyr) + 125 x (cisteína SS bond) . O valor e280 é usado pelo software para cálculo de concentração.
Além de determinação da concentração de ácidos nucléicos e proteínas, o BioSpec-nano pode ser usado como um espectrofotômetro micro-volume ultra-para muitos outros analitos ou como um espectrofotômetro padrão usando 5 células caminho ótico mm.
Protocol
1. Procedimento para quantificação de DNA
- Ligue o instrumento.
- Abra o software BioSpec-nano a partir do desktop PC.
- Clique na guia simples de ácido nucléico-dsDNA (Figura 1).
- O software irá estabelecer a comunicação com o instrumento e executar uma seqüência de inicialização. Esta verifica que o instrumento está funcionando de acordo com as especificações.
- Selecionar 0,7 ou 0,2 milímetros no slider caminho ótico. Isso seleciona o caminho ótico e todos os cálculos são baseados na extensão de caminho selecionado.
- Avançar na BioSpec nano-instalação do software clique em Configurar Autowiping. Selecione 1 ou 2.
- Pipeta mL 2 (0,7 mm) H 2 O ou tampão sobre o pedestal.
- Clique em branco ou F6 para medição em branco. Cada vez que um caminho ótico nova for seleccionada é necessário para gravar um em branco.
- Pipetar 2 mL da amostra no pedestal.
- Clique em Iniciar no software ou empurrar o botão para iniciar no instrumento. A janela superior se move para fazer contato com a gota de amostra. Flashes de xenônio podem ser observados.
- Repita a mesma amostra 3 vezes para determinar a reprodutibilidade.
- Todos os dados gravados são salvos como arquivos. Bud arquivo.
- Para salvar como pdf. Ou. Csv clique em salvar pdf / csv ou F9. Resultados também podem ser salvos como um arquivo csv. Usando a seleção apropriado na guia Salvar.
2. Protocolo para quantificação de proteínas
- Selecione a guia quantificação de proteínas (Figura 2).
- Digite o e280 coeficiente de extinção, se conhecido.
- Se e280 não é conhecido calculá-lo usando e280Calc.
- Selecionar 0,7 ou 0,2 milímetros no slider caminho ótico.
- Clique em Configurar Autowiping-setup. Selecione dois ou mais.
- Pipeta mL 3 (para 0,2 mm) H 2 O ou tampão sobre o pedestal.
- Clique em branco ou F6 para medição em branco.
- Pipeta mL 3 de amostra de proteína sobre o pedestal.
- Clique em Iniciar no software ou empurrar o botão para iniciar no instrumento.
- Repita a mesma amostra 3 vezes para determinar a reprodutibilidade.
- Todos os dados gravados são salvos como arquivos. Bud arquivo
- Para salvar como pdf. Ou. Csv clique em salvar pdf / csv ou F9.
3. Resultados representativos:
1. Resultados para quantificação de DNA
A Figura 3 mostra os dados de medições em uma amostra de DNA típico de dupla fita. A concentração e relação de OD 260/280 calculada também são mostrados. Figura 4 contém resultados reprodutibilidade teste para quantificação de DNA. Os dados das Figuras 3 e 4 mostra os resultados são altamente reprodutíveis, como é evidente a partir do desvio padrão relativamente baixo de 0,26%.
Nota 1:
Imprecisão na quantificação de DNA podem surgir a partir da presença dos componentes do tampão, que pode absorver na região UV. Também é necessário o uso de uma solução de amostra homogênea. Como a quantidade de amostra que está sendo pipetado é apenas 1-2 pipetagem, mL cuidadosa de volumes precisos, sem introdução de quaisquer bolhas é necessária.
2. Resultados para quantificação de proteínas
Figura 5 representa a análise de concentração de proteínas para BSA. A concentração de proteína mcg / mL é com base no valor e280. A Figura 6 mostra a análise da reprodutibilidade. É evidente a partir do desvio padrão relativo de 0,51% que o BioSpec-nano mede a concentração de precisão - não apenas para o DNA, mas também para as proteínas.
Nota 2: Fatores que afetam a concentração de proteína
Determinação da concentração exata de proteína é viável quando existem efeitos mínimo de instabilidade causada pelo pH, buffers, temperatura, ou aditivos. Proteína mais purificada passa por várias etapas de processamento, pelo que é possível que a proteína pode conter tensoativos ou outros aditivos que possam interferir com a formação de gotículas. Para essas amostras, utilizando a cinco milímetros de células de quartzo caminho ótico é altamente recomendado.
Figura 1. Janela de seleção para a quantificação do analito DNA dupla fita
Figura 2. Janela de seleção de analito para a quantificação de proteínas não rotulados
Figura 3. Representante de dados para a quantificação de DNA
Figura 4. Reprodutibilidade de dados para a quantificação de DNA
Figura 5. Dados Representante para quantificação de proteínas
Figura 6. Reprodutibilidade de dados para a quantificação de proteínas
Discussion
O BioSpec-nano foi projetado para resolver problemas atuais inerentes métodos de quantificação de DNA, como resultados inconsistentes e trabalho manual tedioso. Cada medição leva apenas 3 segundos, permitindo que um biólogo molecular experiente para analisar cerca de 3-6 amostras múltiplas em um minuto. O recurso de limpeza única não só melhora o rendimento de medição, ele também elimina a necessidade de limpeza manual dos pedestais, resultando em extravasamento insignificante entre as medidas. Além disso, os testes usando apenas dois toalhetes para as amostras de DNA contendo 1.000 ng / mL, indicado transição menos de 2 ng / mL.
A disponibilidade de uma célula de caminho ótico 5 milímetros oferece uma opção para analisar ácidos nucléicos e diluir amostras de proteínas e estende o uso deste instrumento para outras aplicações.
Disclosures
Suja Sukumaran, PhD é um funcionário da Shimadzu que faz com que o instrumento apresentado neste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| Calf Thymus DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich |
References
- Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
