Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Koncentration Fastställande av nukleinsyror och proteiner med hjälp av Micro-volymen Bio-spec Nano Spektrofotometer

doi: 10.3791/2699 Published: February 17, 2011

Summary

Detta meddelande innehåller uppgifter om noggrannheten och reproducerbarheten av BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometer för dsDNA och protein kvantifiering. Även med extremt små volymer (1 till 2 L), är reproducerbarheten utmärkt, medan den automatiserade torka funktion förbättrar genomströmning och ger minimal överföring för mer exakt resultat.

Abstract

Nukleinsyra kvantifiering förfaranden har avancerat kraftigt under de senaste tre decennierna. Fler och fler, molekylärbiologer kräver konsekvent små volymer analys av nukleinsyra prover för sina experiment. Den BioSpec-nano ger en möjlig lösning på problemen med felaktiga, icke reproducerbara resultat inneboende i dagens DNA-kvantifiering, via specialiserade optik och en känslig PDA detektor. Den BioSpec-nano har också automatiserade funktioner så att montering, mätning och städning görs av instrumentet, och därmed eliminera tråkiga, repetitiva och inkonsekvent placering av fiberoptiska element och manuell rengöring.

I denna studie har data som presenteras på kvantifiering av DNA och protein, samt på mätning reproducerbarhet och noggrannhet. Automatiserad prov kontakt och snabb scanning gör att mätning i tre sekunder, vilket ger en utmärkt genomströmning. Dataanalys utförs med hjälp av den inbyggda funktioner i programvaran. Den formel som används för beräkning av DNA-koncentrationen är:

Exempel Koncentration = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)

Där DF = faktor provspädning och NACF = nukleinsyra koncentration faktor.

Nukleinsyran koncentrationsfaktor är satt i enlighet med analyten vald 1.

Protein koncentration resultat kan uttryckas som mikrogram / ml eller som mol / l genom att ange E280 och molekylära värden vikt respektive. När rester värden för Tyr, trp och cystein (SS bond) förs in i e280Calc fliken är extinktionskoefficienten värden beräknas enligt E280 = 5500 x (Trp rester) + 1490 x (Tyr rester) + 125 x (cystein SS bond) . Det E280 Värdet används av programvaran för koncentrationen beräkning.

Förutom att koncentrationen bestämning av nukleinsyror och protein, kan BioSpec-nano kan användas som en Ultra Micro-volym spektrofotometer för många andra analyter eller som en vanlig spektrofotometer med 5 celler mm vägsträckan.

Protocol

1. Förfarande för DNA Quantitation

  1. Slå på instrumentet.
  2. Öppna BioSpec-nano-programvaran från datorn skrivbord.
  3. Klicka på Enkel nukleinsyra-dsDNA fliken (Figur 1).
  4. Programvaran kommer att upprätta kommunikation med instrumentet och kör en initiering sekvens. Detta verifierar att instrumentet fungerar enligt specifikationerna.
  5. Välj 0,7 eller 0,2 mm på vägsträckan reglaget. Detta väljer den vägsträckan och alla beräkningar är baserade på den valda vägsträckan.
  6. Nästa i BioSpec-nano-programvara på Setup-Autowiping setup. Välj 1 eller 2.
  7. Pipettera 2 mikroliter (för 0,7 mm) H 2 O eller buffert på piedestalen.
  8. Klicka på tomt eller F6 för tomma mätning. Varje gång en ny sträckenhet väljs är det nödvändigt att spela in en tomt.
  9. Pipettera 2 mikroliter av provet på piedestalen.
  10. Klicka på Start i programvaran eller tryck på startknappen på instrumentet. Det övre fönstret går att få kontakt med provet droppen. Xenon blinkar kan observeras.
  11. Upprepa samma prov 3 gånger för att bestämma reproducerbarheten.
  12. All inspelad data som sparas som. Knopp-fil.
  13. För att spara som en. Pdf eller. CSV-fil Klicka på Spara PDF / csv eller F9. Resultaten kan även sparas som en. CSV-fil med hjälp av lämpliga val i fliken Spara.

2. Protokoll för Protein Quantitation

  1. Välj fliken Protein Kvantifiering (Figur 2).
  2. Skriv in E280 extinktionskoefficienten, om den är känd.
  3. Om E280 inte är känd beräkna den med hjälp e280Calc.
  4. Välj 0,7 eller 0,2 mm på vägsträckan reglaget.
  5. Klicka på Setup-Autowiping setup. Välj 2 eller högre.
  6. Pipettera 3 mikroliter (för 0,2 mm) H 2 O eller buffert på piedestalen.
  7. Klicka på tomt eller F6 för tomma mätning.
  8. Pipettera 3 mikroliter av protein prov på piedestalen.
  9. Klicka på Start i programvaran eller tryck på startknappen på instrumentet.
  10. Upprepa samma prov 3 gånger för att bestämma reproducerbarheten.
  11. All inspelad data som sparas som. Knopp-fil
  12. För att spara som en. Pdf eller. CSV-fil Klicka på Spara PDF / csv eller F9.

3. Representativa resultat:

1. Resultat för DNA Quantitation

Figur 3 visar data från mätningar på en typisk dubbelsträngat DNA prov. Koncentrationen och OD 260/280 kvoten beräknas visas också. Figur 4 innehåller resultaten reproducerbara test för DNA-kvantifiering. Uppgifterna i figurerna 3 och 4 visar resultaten är mycket reproducerbara som framgår av det låga relativ standardavvikelse på 0,26%.

Anmärkning 1:

Felaktighet i DNA-kvantifiering kan uppstå genom närvaron av bufferten komponenter som kan absorbera i UV-området. Det är också nödvändigt att använda en homogen provlösningen. Eftersom mängden provet pipetteras är bara 1-2 mikroliter, noggrann pipettering av korrekta volymer utan införandet av bubblor krävs.

2. Resultat för Protein Quantitation

Figur 5 representerar analys proteinkoncentration för BSA. Den mikrogram / ml proteinkoncentration bygger på E280 värde. Figur 6 visar reproducerbarhet analys. Det framgår av den relativa standardavvikelsen på 0,51% att BioSpec-nano åtgärder koncentration exakt - inte bara för DNA utan också för proteiner.

Not 2: Faktorer som påverkar proteinkoncentration

Exakt koncentration bestämning av protein är möjligt när det finns minst effekterna av instabilitet på grund av pH, buffertar, temperatur, eller tillsatser. De flesta renat protein går igenom olika steg i bearbetningen, och därför är det möjligt att proteinet kan innehålla tensider eller andra tillsatser som kan störa hyalindroppsbildning. För dessa prover, med 5 mm cellen sträckenhet kvarts rekommenderas starkt.

Figur 1
Figur 1. Analyten val av fönster för dubbelsträngat DNA kvantifiering

Figur 2
Figur 2. Analyten val av fönster för icke märkta proteinet kvantifiering

Figur 3
Figur 3. Representativa uppgifter för DNA-kvantifiering

Figur 4
Figur 4. Reproducerbarhet uppgifter för DNA-kvantifiering

Figur 5
Figur 5. Representativa uppgifter för protein kvantifiering

"Figur Figur 6. Reproducerbarhet uppgifter för protein kvantifiering

Discussion

Den BioSpec-nano har utvecklats för att lösa aktuella frågor som ingår i DNA-kvantifiering, såsom inkonsekventa resultat och tidskrävande manuellt arbete. Varje mätning tar bara 3 sekunder, vilket gör att en erfaren molekylärbiolog att analysera ca 3-6 flera prover i en minut. Den unika torkar funktion som inte bara förbättrar genomströmning av mätning, den eliminerar också behovet av manuell rengöring av piedestaler, vilket resulterar i försumbar överföring mellan mätningarna. Vidare uppgav tester med bara 2 våtservetter för DNA-prover som innehåller 1000 ng / mikroliter, överföring mindre än 2 ng / mikroliter.

Tillgången till ett 5 mm sträckenhet cell ger en möjlighet att analysera späda nukleinsyra och prover protein och utökar användningen av detta instrument för andra applikationer.

Disclosures

Suja Sukumaran är doktorand anställd av Shimadzu som gör instrumentet presenteras i denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpec-nano Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
Koncentration Fastställande av nukleinsyror och proteiner med hjälp av Micro-volymen Bio-spec Nano Spektrofotometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).More

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter