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Biology

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

doi: 10.3791/2699 Published: February 17, 2011

Summary

Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.

Abstract

Nucleic Acid Quantifizierung Verfahren haben sich in den letzten drei Jahrzehnten fortgeschritten. Mehr und mehr verlangen Molekularbiologen konsequent kleinvolumigen Analyse von Nukleinsäure-Proben für ihre Experimente. Die BioSpec-nano bietet eine mögliche Lösung für die Probleme der ungenauen, nicht reproduzierbare Ergebnisse, inhärent aktuellen DNA-Quantifizierung Methoden, über spezialisierte Optik und ein sensibles PDA-Detektor. Die BioSpec-nano hat auch automatisierte Funktionen, so dass Montage, Messung und Reinigung durch das Instrument fertig sind, wodurch langwierige, sich wiederholende und inkonsistent Platzierung der LWL-Element und manuelle Reinigung.

In dieser Studie werden die Daten auf die Quantifizierung von DNA und Protein, sowie Mess-Genauigkeit und Reproduzierbarkeit vorgestellt. Automatisierte Probenvorbereitung Kontakt und schnelle Abtastung ermöglicht die Messung in 3 Sekunden, was zu einer hervorragenden Durchsatz. Die Datenanalyse erfolgt über die integrierten Funktionen der Software durchgeführt. Die Formel zur Berechnung DNA-Konzentration verwendet wird:

Probenkonzentration = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)

Wo DF = Probe Verdünnungsfaktor und NACF = Nukleinsäure-Konzentration Faktor.

Die Nukleinsäure-Konzentration Faktor ist in Übereinstimmung mit dem Analyten gewählt 1 gesetzt.

Protein-Konzentration Ergebnisse können als pg / mL oder als mol / L durch Eingabe e280 und dem Molekulargewicht Werte ausgedrückt werden. Wenn Rückstände Werte für Tyr, Trp und Cystein (SS-Bindung) in der e280Calc Registerkarte eingegeben werden, sind die Extinktionskoeffizienten Werte wie e280 berechnet = 5500 x (Trp-Reste) + 1490 x (Tyr-Reste) + 125 x (Cystein SS-Bindung) . Die e280-Wert wird durch die Software für die Berechnung der Konzentration verwendet.

Neben Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen, kann die BioSpec-nano als ultra micro-Volumen Spektralphotometer für viele andere Analyten oder als Standard-Spektralphotometer mit 5 mm Schichtdicke Zellen verwendet werden.

Protocol

1. Verfahren zur DNA-Quantifizierung

  1. Schalten Sie das Gerät.
  2. Öffnen Sie die BioSpec-nano-Software aus dem PC-Desktop.
  3. Klicken Sie auf das Einfache Nucleic Acid-dsDNA Registerkarte (Abbildung 1).
  4. Die Software wird die Kommunikation mit dem Gerät herzustellen und führen eine Initialisierung Sequenz. Dies bestätigt, dass das Gerät nach Angaben der Durchführung.
  5. Wählen Sie 0,7 oder 0,2 mm über die Weglänge Schieberegler. Diese wählt die Weglänge und alle Berechnungen basieren auf der Weglänge ausgewählt wurden.
  6. Next in BioSpec-nano-Software klicken Sie auf Setup-Autowiping Setup. Wählen Sie 1 oder 2.
  7. Pipette 2 ul (für 0,7 mm) H 2 O oder Puffer auf dem Podest.
  8. Klicken Sie auf leere oder F6 für Blank-Messung. Jedes Mal, wenn eine neue Schichtdicke gewählt wird, ist es notwendig, um einen leeren Datensatz.
  9. Pipette 2 ul der Probe auf dem Podest.
  10. Klicken Sie auf Start in der Software oder drücken Sie den Startknopf auf dem Instrument. Das obere Fenster bewegt, den Kontakt mit der Probe Tropfen zu machen. Xenon-Blitze beobachtet werden können.
  11. Wiederholen Sie die gleiche Probe 3 mal um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen.
  12. Alle aufgezeichneten Daten ist. Bud-Datei gespeichert.
  13. Zum Speichern als. Pdf oder. Csv-Datei klicken Sie auf Speichern pdf / csv oder F9. Die Ergebnisse können auch als. Csv-Datei, indem Sie die entsprechende Auswahl in der Registerkarte Speichern gespeichert werden.

2. Protokoll für Protein Quantifizierung

  1. Wählen Protein Quantifizierung Registerkarte (Abbildung 2).
  2. Geben Sie den Extinktionskoeffizienten e280, falls bekannt.
  3. Wenn e280 nicht bekannt ist, berechnen sie mit e280Calc.
  4. Wählen Sie 0,7 oder 0,2 mm über die Weglänge Schieberegler.
  5. Klicken Sie auf Setup-Autowiping Setup. Wählen Sie 2 oder höher.
  6. Pipette 3 ul (für 0,2 mm) H 2 O oder Puffer auf dem Podest.
  7. Klicken Sie auf leere oder F6 für Blank-Messung.
  8. Pipette 3 ul der Proteinprobe auf dem Podest.
  9. Klicken Sie auf Start in der Software oder drücken Sie den Startknopf auf dem Instrument.
  10. Wiederholen Sie die gleiche Probe 3 mal um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen.
  11. Alle aufgezeichneten Daten ist. Bud-Datei gespeichert
  12. Zum Speichern als. Pdf oder. Csv-Datei klicken Sie auf Speichern pdf / csv oder F9.

3. Repräsentative Ergebnisse:

1. Ergebnisse für die DNA-Quantifizierung

Abbildung 3 zeigt die Daten aus Messungen an einem typischen doppelsträngige DNA-Probe. Die Konzentration und OD 260/280 Ratio berechnet werden ebenfalls gezeigt. Abbildung 4 enthält die Reproduzierbarkeit Testergebnisse für DNA-Quantifizierung. Die Daten in den Abbildungen 3 und 4 zeigt die Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar, wie aus den niedrigen relativen Standardabweichung von 0,26%.

Hinweis 1:

Ungenauigkeit in der DNA-Quantifizierung kann durch die Anwesenheit von Puffer-Komponenten, die im UV-Bereich absorbieren entstehen können. Es ist auch notwendig, um eine homogene Probe-Lösung verwenden. Da die Höhe der Probe pipettiert nur 1-2 ul, vorsichtiges Pipettieren von genauen Mengen ohne Einführung von Blasen ist nicht erforderlich.

2. Ergebnisse für Protein Quantifizierung

Abbildung 5 zeigt Proteinkonzentration Analyse für BSA. Die ug / ml Proteinkonzentration ist auf der e280-Wert. Abbildung 6 zeigt die Reproduzierbarkeit Analyse. Daraus ist ersichtlich, dass die relative Standardabweichung von 0,51%, dass die BioSpec-nano-Konzentration misst präzise - nicht nur für DNA, sondern auch für Proteine.

Hinweis 2: Faktoren, die die Protein-Konzentration

Genaue Konzentration Bestimmung von Protein ist machbar, wenn es mindestens Effekte aus Instabilität, die durch pH, ​​Puffer, Temperatur oder Zusätze verursacht. Die meisten gereinigtes Protein durchläuft verschiedene Stufen der Verarbeitung, daher ist es möglich, dass das Protein Tenside oder andere Zusatzstoffe, die mit Tropfenbildung stören kann. Für solche Proben, mit dem 5 mm Schichtdicke Quarzküvette wird dringend empfohlen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Analyte Auswahlfenster für doppelsträngige DNA-Quantifizierung

Abbildung 2
Abbildung 2. Analyte Auswahlfenster für nicht markiertes Protein-Quantifizierung

Abbildung 3
Abbildung 3. Repräsentative Daten zur DNA-Quantifizierung

Abbildung 4
Abbildung 4. Reproduzierbarkeit von Daten für die DNA-Quantifizierung

Abbildung 5
Abbildung 5. Repräsentative Daten für die Protein-Quantifizierung

"Bild Abbildung 6. Reproduzierbarkeit von Daten für die Protein-Quantifizierung

Discussion

Die BioSpec-nano wurde entwickelt, um aktuelle Themen innewohnenden DNA-Quantifizierung Methoden, wie inkonsistente Ergebnisse und mühsame Handarbeit zu lösen. Jede Messung dauert nur 3 Sekunden, so dass ein erfahrener Molekularbiologe ungefähr 3-6 mehrere Proben in einer Minute zu analysieren. Die einzigartige Scheibenwischer-Funktion verbessert nicht nur den Durchsatz der Messung, es entfällt auch die Notwendigkeit für die manuelle Reinigung der Container, die sich in vernachlässigbaren Verschleppung zwischen den Messungen. Darüber hinaus gaben Tests unter Verwendung von nur 2 Tücher für die DNA-Proben mit 1000 ng / ul, Verschleppung von weniger als 2 ng / ul.

Die Verfügbarkeit einer 5 mm Schichtdicke Zelle enthält eine Option zum verdünnen Nukleinsäure-und Protein-Proben analysieren und erweitert den Einsatz dieses Instruments für andere Anwendungen.

Disclosures

Suja Sukumaran ist PhD Mitarbeiter von Shimadzu, der das Instrument in diesem Artikel vorgestellten macht.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpec-nano Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

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References

  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer
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Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).More

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

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