Summary
Cette communication présente des données sur la précision et la reproductibilité des BioSpec nano-UV-VIS spectrophotomètre pour ADNdb et la quantification des protéines. Même avec ultra-petits volumes (1 à 2 L), la reproductibilité est excellente, tandis que la fonction automatisée essuyant améliore le débit et les résultats de report minimale pour obtenir des résultats plus précis.
Abstract
Nucleic Acid procédures de quantification ont considérablement progressé au cours des trois dernières décennies. De plus en plus, des biologistes moléculaires nécessitent cohérente petit volume d'analyse d'échantillons d'acides nucléiques pour leurs expériences. Les nano-BioSpec fournit une solution potentielle aux problèmes de la inexactes, les résultats non reproductibles, inhérente à la quantification méthodes actuelles de l'ADN, via l'optique spécialisée et un détecteur sensible PDA. Le BioSpec-nano a aussi des fonctionnalités automatisées telles que le montage, la mesure et de nettoyage sont effectuées par l'instrument, éliminant ainsi le placement fastidieuse, répétitive et incohérente de l'élément de fibre optique et le nettoyage manuel.
Dans cette étude, les données sont présentées sur la quantification de l'ADN et de protéines, ainsi que sur la reproductibilité et la précision de mesure. Contact avec l'échantillon automatisée et balayage rapide permet de mesurer en trois secondes, résultant en un débit excellent. L'analyse des données est effectué en utilisant les fonctionnalités intégrées dans le logiciel. La formule utilisée pour calculer la concentration en ADN est la suivante:
Concentration de l'échantillon = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)
Où DF = facteur de dilution de l'échantillon et NACF = facteur de concentration d'acide nucléiques.
Le facteur de concentration d'acide nucléique est fixé en conformité avec l'analyte sélectionné 1.
Résultats de concentration en protéines peut être exprimée en pg / mL ou en moles / L en entrant e280 et les valeurs de poids moléculaire respectivement. Lorsque les valeurs des résidus pour Tyr, Trp et la cystéine (SS obligataires) sont entrés dans l'onglet e280Calc, les valeurs du coefficient d'extinction sont calculés comme e280 = 5500 x (résidus Trp) + 1490 x (résidus Tyr) + 125 x (cystéine SS obligataire) . La valeur E280 est utilisé par le logiciel pour le calcul de la concentration.
En plus de détermination de la concentration des acides nucléiques et les protéines, les nano-BioSpec peut être utilisé comme un ultra micro-volume spectrophotomètre pour beaucoup d'autres analytes ou comme un spectrophotomètre standard utilisant des cellules 5 mm trajet optique.
Protocol
1. Procédure pour la quantification d'ADN
- Tournez sur l'instrument.
- Ouvrez le logiciel BioSpec-nano à partir du PC de bureau.
- Cliquez sur l'acide nucléique simple-ADNdb onglet (figure 1).
- Le logiciel va établir la communication avec l'instrument et d'exécuter une séquence d'initialisation. Cela permet de vérifier que l'instrument effectue conformément aux spécifications.
- Sélectionnez 0,7 ou 0,2 mm sur le curseur trajet optique. Cela sélectionne le trajet optique et tous les calculs sont basés sur le trajet optique sélectionné.
- Suivant dans BioSpec nano-cliquez logiciel de configuration-Autowiping configuration. Sélectionnez 1 ou 2.
- Pipeter 2 uL (pour 0,7 mm) H 2 O ou mémoire tampon sur le piédestal.
- Cliquez vierge ou F6 pour la mesure de vide. Chaque fois qu'une nouvelle trajet optique est sélectionné, il est nécessaire d'enregistrer un blanc.
- Pipeter 2 uL d'échantillon sur le piédestal.
- Cliquez sur Démarrer dans le logiciel ou poussez le bouton de démarrage de l'instrument. La fenêtre supérieure se déplace pour prendre contact avec la goutte d'échantillon. Clignote au xénon peuvent être observés.
- Répétez le même échantillon 3 fois pour déterminer la reproductibilité.
- Toutes les données enregistrées sont enregistrées au format. Bourgeon fichier.
- Pour enregistrer au format pdf. Ou. Csv cliquez sur Enregistrer pdf / csv ou F9. Les résultats peuvent également être sauvegardées dans un fichier. Csv en utilisant la sélection appropriée dans l'onglet Enregistrer.
2. Protocole pour la quantification des protéines
- Sélectionnez l'onglet quantification des protéines (figure 2).
- Entrez le e280 coefficient d'extinction, si elle est connue.
- Si E280 n'est pas connu de calculer à l'aide e280Calc.
- Sélectionnez 0,7 ou 0,2 mm sur le curseur trajet optique.
- Cliquez sur Configuration-Autowiping configuration. Sélectionnez 2 ou supérieur.
- Pipette 3 pi (0,2 mm) H 2 O ou mémoire tampon sur le piédestal.
- Cliquez vierge ou F6 pour la mesure de vide.
- Pipette 3 uL d'échantillon de la protéine sur le piédestal.
- Cliquez sur Démarrer dans le logiciel ou poussez le bouton de démarrage de l'instrument.
- Répétez le même échantillon 3 fois pour déterminer la reproductibilité.
- Toutes les données enregistrées sont enregistrées au format. Bourgeon de fichier
- Pour enregistrer au format pdf. Ou. Csv cliquez sur Enregistrer pdf / csv ou F9.
3. Les résultats représentatifs:
1. Résultats pour la quantification d'ADN
La figure 3 montre les données à partir de mesures sur un échantillon typique d'ADN double brin. La concentration et OD 260/280 ratio calculé sont également représentées. La figure 4 contient les résultats des tests de reproductibilité pour la quantification d'ADN. Les données des figures 3 et 4 résultats montre sont hautement reproductibles comme en témoigne le faible écart type relatif de 0,26%.
Note 1:
Imprécision dans la quantification d'ADN peuvent découler de la présence des composants du tampon qui peut absorber dans la région UV. Il est également nécessaire d'utiliser une solution d'échantillon homogène. Comme la quantité d'échantillon étant pipette est seulement 1-2 uL, pipetage minutieux des volumes précis sans l'introduction de toute bulle est nécessaire.
2. Résultats pour quantification des protéines
La figure 5 représente l'analyse la concentration de protéines pour BSA. La concentration en protéines pg / ml est basé sur la valeur e280. La figure 6 montre l'analyse de reproductibilité. Il est évident d'après l'écart type relatif de 0,51% que le BioSpec nano-mesures de la concentration précisément - non seulement pour l'ADN, mais aussi pour les protéines.
Note 2: Facteurs influant sur la concentration de protéines
Détermination de la concentration de protéines précis est réalisable quand il ya un minimum d'effets de l'instabilité provoquée par le pH, tampons, la température ou d'additifs. La plupart des protéines purifiées passe par différentes étapes de traitement, d'où il est possible que la protéine peut contenir des agents tensioactifs ou d'autres additifs qui peuvent interférer avec la formation de gouttelettes. Pour ces échantillons, en utilisant la cellule de 5 mm trajet optique de quartz est fortement recommandée.
Figure 1. Fenêtre de sélection Analyte pour la quantification d'ADN double brin
Figure 2. Fenêtre de sélection d'analyte pour la quantification des protéines non étiquetés
Représentant des données Figure 3. Pour la quantification d'ADN
La reproductibilité des données Figure 4. Pour la quantification d'ADN
Figure 5. Données représentatives pour la quantification des protéines
Figure 6. Données de reproductibilité pour la quantification des protéines
Discussion
Les nano-BioSpec a été conçu pour résoudre les problèmes actuels inhérents aux méthodes de quantification de l'ADN, telles que des résultats incohérents et le travail manuel fastidieux. Chaque mesure ne prend que 3 secondes, permettant à un biologiste expérimenté moléculaire pour analyser plusieurs échantillons d'environ 3-6 en une minute. La fonction d'essuie-glace unique, non seulement améliore le débit de la mesure, il élimine également le besoin pour le nettoyage manuel des piédestaux, résultant en report négligeables entre les mesures. Par ailleurs, des tests en utilisant seulement 2 lingettes pour les échantillons d'ADN contenant 1000 ng / uL, a indiqué report moins de 2 ng / mL.
La disponibilité d'une cellule de 5 mm trajet optique fournit une option pour analyser diluer l'acide nucléique et des protéines des échantillons et s'étend à l'utilisation de cet instrument pour d'autres applications.
Disclosures
Suja Sukumaran, Ph.D. est un employé de Shimadzu qui fait l'instrument présenté dans cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| Calf Thymus DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich |
References
- Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
