Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.
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Methodenartikel
Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Typ 1 Diabetes (T1D) ist eine T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen. Während der Pathogenese, werden Patienten zunehmend insulinopenic als Insulin-Produktion ist verloren, vermutlich Dies ergibt sich aus der Zerstörung der Betazellen des Pankreas durch T-Zellen. Das Verständnis der Mechanismen der Beta-Zell Tod während der Entwicklung von T1D liefert Einblicke in ein wirksames Heilmittel für diese Krankheit zu erzeugen. Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays haben in der Vergangenheit das Radionuklid Chromium 51 (51 Cr) verwendet werden, um Zielzellen Etikett. Diese Ziele werden dann zu Effektor-Zellen ausgesetzt und die Freisetzung von 51 Cr von Zielzellen ist als ein Hinweis auf Lymphozyten-vermittelten Zelltod zu lesen. Inhibitoren der Zelltod führen zu einer verminderten Freisetzung von 51 Cr.
Als Effektorzellen, haben wir eine aktivierte autoreaktive klonale Population von CD8 + zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) aus einer Maus Lager transgenen sowohl für die alpha-und beta-Ketten des AI4 T-Zell-Rezeptor (TCR) isoliert. Aktiviert AI4 T-Zellen wurden mit 51 Cr markierten Target NIT-Zellen für 16 Stunden ko-kultiviert, die Freisetzung von 51 Cr wurde aufgezeichnet, um spezifische Lyse berechnet
Mitochondrien in vielen wichtigen physiologischen Ereignisse, wie die Energieproduktion, die Regulierung der Signalweiterleitung und Apoptose beteiligt. Das Studium der Beta-Zell-Mitochondrien funktionelle Veränderungen bei der Entwicklung von T1D ist ein neuartiges Gebiet der Forschung. Mit der mitochondrialen Membranpotentials Farbstoff Tetramethylrhodamin Methyl Ester (TMRM) und konfokale Mikroskop live cell imaging, verfolgten wir Mitochondrienmembranpotential im Laufe der Zeit in der Beta-Zell-Linie NIT-1. Für die Bildgebung Studien wurden Effektor AI4 T-Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Kernfärbung PicoGreen gekennzeichnet. NIT-1-Zellen und T-Zellen wurden in Kammern Deckglas co-kultiviert und montiert auf dem Mikroskoptisch mit einer lebenden Zelle Kammer ausgestattet, kontrolliert bei 37 ° C, mit 5% CO 2, und befeuchtet. Bei diesen Experimenten Bilder wurden von jedem Cluster alle 3 Minuten für 400 Minuten gedauert.
Über einen Zeitraum von 400 Minuten, beobachteten wir die Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials in NIT-1-Zell-Cluster, wo AI4 T-Zellen wurden angebracht. In der gleichzeitigen Steuerung Experiment, bei dem NIT-1-Zellen mit MHC wurden co-kultivierten mis-abgestimmt menschliche Lymphozyten Jurkat-Zellen, blieb Mitochondrienmembranpotential intakt. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen in Echtzeit in mitochondrialen Membranpotentials in Zellen unter Beschuss von zytotoxischen Lymphozyten, Zytokinen oder anderen zytotoxischen Reagenzien zu beobachten.
Protokoll
1. Vorbereitung der Zellen
- Ziel der Zellkultur: Kultur der Maus Beta-Zell-Linien, NIT-1 und NIT-4 wurde ein zuvor beschriebenen 1,2 in DMEM mit 10% FBS, 0,02% BSA, Non-essentielle Aminosäure, 15 mM HEPES, 16.5mm ergänzt Glocose und Penicillin / Streptomycin. Für 51 Cr Kennzeichnung, Samenzellen in einem flachem Boden 96-well-Kulturplatte bei 5x10 4 Zellen / well in 200 ul Kulturmedium. Für die Mikroskopie Experimente Samenzellen in einem 8-well Lab-Tak II chambered Deckglas bei 5x10 4 pro Kammer in 500 ul Kulturmedium, und lassen Sie es 48 Stunden vor wachsen, um mit in die Zytotoxizität Experimente.
- Co....
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Diskussion
Zytotoxische T-Zell-vermittelten beta Zelltod ist die wichtigste Pathophysiologie der T1D 5. CML-Assays mit 51 Cr Freisetzung ermöglichen es uns, den Grad der Effektor-Target-Reaktion 6 Studie. Allerdings ist der detaillierte Prozess und Wege der T-Zell-vermittelten Zelltod beta noch nicht vollständig verstanden. Da Mitochondrien entscheidend für Beta-Zell-Funktion und der Tod 7 sind, konzentrierten wir uns auf die mitochondriale Veränderungen während der visuellen CML. Mitoch.......
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Offenlegungen
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Florida Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK074656 und AI56374 (CEM), sowie die Juvenile Diabetes Research Foundation unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | CellGro | 21-040-60 | |
| Tetramethylrhodamin Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| PicoGreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 Mimotop | mimotopes.com | Aminosäuresequenz: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | CellGro | 25 bis 060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin / Streptomycin | Zwillinge | 400-109 | |
| Phenolrot-freiem DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2-Inkubator | Thermo Fisher | HERAcell 150i | Steril gehalten für die Zellkultur |
| Biologische Sicherheitswerkbank | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Einweg-Kultur Röhren, 6x50 mm Kalk-Glas | Fischer | 14 bis 958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Konfokalen Mikroskop | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | Mit motorisierten Bühne und Live-Cell-Kammer |
| Pipette (1 ml, 200 ul, 20 &mgr; l, 10 &mgr; l, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fischer | 50819772 | |
| Zentrifuge | Sorvall Legend RT + | 75004377 | |
| Hämazytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Aufrechte Mikroskope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Mäuse | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Mäuse | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α / β F1-Mäusen | N / A | N / A | Gezüchtet in UF Tierhaltung |
Referenzen
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
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Nachdrucke und Genehmigungen
