Summary
Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.
Abstract
Typ 1 Diabetes (T1D) ist eine T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen. Während der Pathogenese, werden Patienten zunehmend insulinopenic als Insulin-Produktion ist verloren, vermutlich Dies ergibt sich aus der Zerstörung der Betazellen des Pankreas durch T-Zellen. Das Verständnis der Mechanismen der Beta-Zell Tod während der Entwicklung von T1D liefert Einblicke in ein wirksames Heilmittel für diese Krankheit zu erzeugen. Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays haben in der Vergangenheit das Radionuklid Chromium 51 (51 Cr) verwendet werden, um Zielzellen Etikett. Diese Ziele werden dann zu Effektor-Zellen ausgesetzt und die Freisetzung von 51 Cr von Zielzellen ist als ein Hinweis auf Lymphozyten-vermittelten Zelltod zu lesen. Inhibitoren der Zelltod führen zu einer verminderten Freisetzung von 51 Cr.
Als Effektorzellen, haben wir eine aktivierte autoreaktive klonale Population von CD8 + zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) aus einer Maus Lager transgenen sowohl für die alpha-und beta-Ketten des AI4 T-Zell-Rezeptor (TCR) isoliert. Aktiviert AI4 T-Zellen wurden mit 51 Cr markierten Target NIT-Zellen für 16 Stunden ko-kultiviert, die Freisetzung von 51 Cr wurde aufgezeichnet, um spezifische Lyse berechnet
Mitochondrien in vielen wichtigen physiologischen Ereignisse, wie die Energieproduktion, die Regulierung der Signalweiterleitung und Apoptose beteiligt. Das Studium der Beta-Zell-Mitochondrien funktionelle Veränderungen bei der Entwicklung von T1D ist ein neuartiges Gebiet der Forschung. Mit der mitochondrialen Membranpotentials Farbstoff Tetramethylrhodamin Methyl Ester (TMRM) und konfokale Mikroskop live cell imaging, verfolgten wir Mitochondrienmembranpotential im Laufe der Zeit in der Beta-Zell-Linie NIT-1. Für die Bildgebung Studien wurden Effektor AI4 T-Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Kernfärbung PicoGreen gekennzeichnet. NIT-1-Zellen und T-Zellen wurden in Kammern Deckglas co-kultiviert und montiert auf dem Mikroskoptisch mit einer lebenden Zelle Kammer ausgestattet, kontrolliert bei 37 ° C, mit 5% CO 2, und befeuchtet. Bei diesen Experimenten Bilder wurden von jedem Cluster alle 3 Minuten für 400 Minuten gedauert.
Über einen Zeitraum von 400 Minuten, beobachteten wir die Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials in NIT-1-Zell-Cluster, wo AI4 T-Zellen wurden angebracht. In der gleichzeitigen Steuerung Experiment, bei dem NIT-1-Zellen mit MHC wurden co-kultivierten mis-abgestimmt menschliche Lymphozyten Jurkat-Zellen, blieb Mitochondrienmembranpotential intakt. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen in Echtzeit in mitochondrialen Membranpotentials in Zellen unter Beschuss von zytotoxischen Lymphozyten, Zytokinen oder anderen zytotoxischen Reagenzien zu beobachten.
Protocol
1. Vorbereitung der Zellen
- Ziel der Zellkultur: Kultur der Maus Beta-Zell-Linien, NIT-1 und NIT-4 wurde ein zuvor beschriebenen 1,2 in DMEM mit 10% FBS, 0,02% BSA, Non-essentielle Aminosäure, 15 mM HEPES, 16.5mm ergänzt Glocose und Penicillin / Streptomycin. Für 51 Cr Kennzeichnung, Samenzellen in einem flachem Boden 96-well-Kulturplatte bei 5x10 4 Zellen / well in 200 ul Kulturmedium. Für die Mikroskopie Experimente Samenzellen in einem 8-well Lab-Tak II chambered Deckglas bei 5x10 4 pro Kammer in 500 ul Kulturmedium, und lassen Sie es 48 Stunden vor wachsen, um mit in die Zytotoxizität Experimente.
- Control T-Zelllinie Kultur: Verwenden Sie die Jurkat-Zelllinie (ATCC, CD3 + Lymphozyten menschlichen Zelllinie) als negative Kontrolle. Kultur Jurkat-Zellen in RPMI1640 mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1,5 g / L Natriumbikarbonat, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat.
2. Sammlung und Aktivierung von Effektorzellen autoreaktiven CD8 + T-Zellen
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] und NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) gekauft und gezüchtet in unserer Maus Anlage. F1-Hybrid Nachkommen aus Paarungen von NOD-AI4a mit NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] zu entwickeln Diabetes bei 3-5 Wochen alt sind. Alle Mäuse wurden in specific pathogen-free Einrichtungen untergebracht und vom zuständigen Organ der Animal Care und Verwenden Committee.
- Euthanize 3-4 Wochen alten NOD-AI4a / b Mäuse mit CO 2.
- Sammeln Milz von Mäusen. Eingeschläfert Mäuse sind mit Ethanol Spray präpariert und geöffnet unter chirurgischen Kapuze. Milzen entnommen und in eiskaltem HBSS-Puffer sofort.
- Sammeln Milzzellen mit einem 7 ml Glas-Homogenisator. Zwei bis drei Milzen jeweils in 5 ml kaltem HBSS gelegt und homogenisiert mit einem 7 ml Glas-Homogenisator. Homogenat wird gesammelt und bei 1200rpm zentrifugiert 5 Minuten bei 4 ° C mit einem Sorvall RT7 + Zentrifuge. Die Zellpellets werden gesammelt.
- Entfernen Sie rote Blutkörperchen mit hypotonen Lösung behandelt. Pellets mit 5 ml hypotonische Lösung / Milz auf Eis für 5 Minuten behandelt, anschließend durch Zugabe eines gleichen Volumens HBSS neutralisiert. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wie oben, und resuspendieren in 50 ml HBSS. Pass die suspendierten Zellen durch Zell-Sieb und rechnen mit einer Zählkammer mit Trypanblau-Färbung.
- Zellen aktivieren. Die Zellen auf 5x10 6 / ml und aktivieren Sie mit einem 3-tägigen Kultur mit 0,1 uM AI4 Mimotop (Aminosäuresequenz YFIENYLEL) und 25 U / ml IL-2 in RPMI1640 mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1,5 g / L Natriumbikarbonat, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat.
3. 51 Cr-Freisetzungs-Assay zu untersuchen, CML
- Label-Ziel-Zellen: In 51 Cr, um Zellen mit 1 Ziel uCi / Vertiefung und Kultur für 3 Stunden und 3 x waschen mit Kulturmedium.
- Suspend-Effektorzellen in RPMI 1640 Medium, wie in Schritt 2.5 erwähnt, so dass das Endvolumen in jede Vertiefung gegeben ist 200 ul.
- Nach dem letzten Waschen der markierten Zielzellen, fügen aktivierten Effektor-Zellen, die Zielzelle Kulturen gewünschten Effektor (E: T) Zielkennzahlen. Wir verwenden normalerweise E: T-Verhältnissen bei 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 und 50:1.
- Add frischen modifizierten RPMI 1640-Medium (siehe Schritt 2.5) bis 6 Vertiefungen der Zielzellen als eine spontane Lyse Kontrolle zu handeln.
- Co-Kultur Effektor-und Zielzellen für 16 Stunden.
- Sammeln Sie in 6x50 mm Lime Glasröhren Überstand
- Lyse-Zellen durch Zugabe von 100 &mgr; l 2% SDS und Abpipettieren sanft.
- Sammeln Zelllysat in eine andere Gruppe von 6x50 mm Lime Glasröhren.
- Wash Brunnen einmal mit sauberem H 2 O und fügen Sie die Wäsche nach dem Zelllysat Röhren.
- Zählen Sie die Überstände und Zelllysaten mit einem Gamma-Counter.
- Berechnen Sie spezifische Lyse wie folgt:
4. Die Färbung von Zellen für Live Cell Imaging
Unter gebräuchlichsten Mitochondrienmembranpotential Farbstoffe, TMRM am wenigsten mitochondriale Toxizität aufweist. 3 Darum wählen wir TMRM für diese Live Cell Imaging-Studien.
- Bereiten Sie eine 40 mM Lager TMRM Lösung in DMSO und bei -20 ° C. Machen Sie eine [25 nM] frischen Arbeitslösung in Phenolrot-freiem DMEM mit allen Ergänzungen für NIT-1-Zellkultur 1.
- Stain Ziel NIT-1-Zellen mit TMRM 25 nM für 30 min bei 37 ° C.
- Ersetzen Sie die Medien mit frischem Medium mit 5 nM TMRM die Gleichgewichtsverteilung der Farbstoff 4 aufrecht zu erhalten.
- Graf aktivierten Effektor-T-Zellen AI4 mit einer Zählkammer.
- Stain aktivierten Effektor-T-Zellen AI4 mit 1 ul / ml PicoGreen für5 Minuten bei Raumtemperatur und wäscht mit Phenolrot-freiem Kulturmedium 3 mal.
5. Bestimmung der T-Lymphozyten-vermittelte beta Zelltod mit Live Cell Imaging
- Montieren Sie den Kammern Deckglas mit bunten NIT-Zellen auf der Bühne eines Zeiss LSM 510 konfokalen Mikroskop. Entfernen Sie die Registerkarte mit einem dremmel und Gas sterilisieren chambered Glas mit Etheline Oxid. Die Bühne ist mit einem Live-Cell-Imaging Kammer, dass die Temperatur kontrolliert bei 37 ° C und 5% CO 2 mit Feuchtigkeit. Ausgerüstet ist
- Add aktiviert und gefärbt T-Zellen an bestimmte Kammern bei verschiedenen E: T-Verhältnissen.
- Hinzugefügt gleiche Anzahl von gefärbten Jurkat-Zellen, die Kontrolle Kammern.
6. Abrufen von Online-Zelle Bilder
Das Mikroskop ist mit einem motorisierten Bühne, die uns immer wieder zu erwerben Bilder an verschiedenen Orten aus den gleichen oder verschiedenen Kammern automatisch über den zeitlichen Verlauf des Experiments erlaubt ausgestattet.
- Mit einem 63x Öl Objektiv nehmen Bilder im Abstand von alle 3 Minuten für eine Gesamtmenge von 300 Bildern pro Standort.
- Detect TMRM Färbung mit einer Anregungswellenlänge von 543 nm und Filter-Set für die Emission 565-619 nm
- Detect PicoGreen Färbung mit einer Anregung 488 nm und einem Filter-Set für Emission 500-630 nm. Das Video wurde mit Zeiss LSM-Software.
7. Video-Konvertierung für die Veröffentlichung
- Mit dem Zeiss LSM Software, erstellen Sie eine komprimierte Filmdatei in eine AVI-Format.
- So konvertieren Sie das Video in das Format veröffentlicht, importieren Sie das Video in das Software-Paket FIJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ein ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / )-Verteilung, mit dem Bioformats Plugin von Loci ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Passen Sie die Helligkeit und Kontrast zu den grünen und roten Signalen und die Frame-Rate auf 2 Bilder / Sekunde mit der Animation Optionsmenü eingestellt Gleichgewicht.
- Crop das Video zu 512 x 512 Pixel und Export als unkomprimierte AVI-Datei.
- Öffnen Sie diese AVI-Datei in die Software Quicktime 7 (Apple Computer, Cupertino, CA) und komprimieren und Export in die offene Video-Format H264/MPEG-4 bei 1200 kbs / Sekunde.
8. Repräsentative Ergebnisse:
- Ein repräsentatives Ergebnis von 51 Cr CML-Assay. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis eines CML-Assay, wo Prozent spezifische Lyse (Y-Achse) steigt mit der Effektor: Target-Verhältnis (X-Achse) erhöht. Zielzellen sind primäre Inseln aus immundefizienten NOD isoliert Rag1-/ -. Mäusen und markiert mit 51 Cr. Milzzellen aus NOD.AI4α / β transgenen Mäusen isoliert und aktiviert, wie in Schritt 2 oben beschrieben. Ziele und Effektoren wurden co-kultiviert für 16 Stunden. Prozent spezifische Lyse berechnet, wie in Schritt 3.11 als beschrieben.
- Zwei Vertreter (positiven und negativen) Ergebnisse einer T-Zell-vermittelten Beta-Zell-Mitochondrienmembranpotential Verlustleistung vorgestellt werden. Die Zellen werden gefärbt und Reaktionen aufgezeichnet werden wie in den Schritten 4, 5 und 6 beschrieben, Video-Dateien wie in Schritt 7 erstellt haben. Video 1: Die Maus Beta-Zell-Linie NIT-1 gefärbt wurde die mitochondriale Membranpotential Farbstoff TMRM (Red). T-Verhältnis von 50:1: Aktiviert, autoreaktiven CD8 + T-Zell-AI4 (grün gefärbt mit PicoGreen) wurden mit diesen NIT-1-Zellen in einer E co-kultiviert. NIT-1 Mitochondrienmembranpotential allmählich während einer 400-Minuten Dauer abgeführt, sondern nur in den Clustern, die mit AI4 T-Zellen interagieren wurden. Video 2: Wie ein Kontrollexperiment, NIT-1-Zellen wurden mit TMRM und co-kultiviert mit PicoGreen gebeizt Jurkat-Zellen in einer E gefärbt: T-Verhältnis von 50:1. Jurkat-Zellen sind eine menschliche T-Zell-Linie, die MHC mismatched ist. NIT-1-Zellen aufrechterhalten mitochondrialen Membranpotentials während der gesamten Dauer des 400 Minuten Co-Inkubation. Jurkat-Zellen nicht mit NIT-1-Cluster interagieren und daher nicht dazu veranlassen, zu töten.
Abbildung 1 repräsentatives Ergebnis von CML Verwendung als Zielzellen primären Inseln aus immundefizienten NOD.Rag1-/ isoliert -. Mäusen und Milzzellen aus NOD.AI4α / β transgenen Mäusen. Ziele und Effektoren wurden co-kultiviert für 16 Stunden. Prozent spezifische Lyse erhöht als Effektor: Target-Verhältnis erhöht.
Video 1. Maus Beta-Zell-Linie NIT-1 war der mitochondrialen Membranpotentials Farbstoff TMRM (Red) gefärbt. Aktivierte autoreaktive CD8 + T-Zell-AI4 (grün gefärbt mit PicoGreen) wurden mit diesen NIT-1-Zellen bei E co-kultiviert: T-Verhältnis von 50:1. NIT-1 Mitochondrienmembranpotential DissipationTed allmählich während einer 400-Minuten Dauer, sondern nur in den Clustern, die mit grünen AI4 T-Zellen interagieren wurden. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen .
Video 2. NIT-1-Zellen wurden wie in Video 1 und co-kultiviert mit PicoGreen gebeizt menschliche T-Zell-Linie Jurkat beschrieben gefärbt. NIT-1-Zellen konnten Mitochondrienmembranpotential durchdacht die Dauer von 400 Minuten aufrecht zu erhalten. Jurkat-Zellen nicht mit NIT-1-Cluster interagieren und daher nicht dazu veranlassen, zu töten. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen .
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Discussion
Zytotoxische T-Zell-vermittelten beta Zelltod ist die wichtigste Pathophysiologie der T1D 5. CML-Assays mit 51 Cr Freisetzung ermöglichen es uns, den Grad der Effektor-Target-Reaktion 6 Studie. Allerdings ist der detaillierte Prozess und Wege der T-Zell-vermittelten Zelltod beta noch nicht vollständig verstanden. Da Mitochondrien entscheidend für Beta-Zell-Funktion und der Tod 7 sind, konzentrierten wir uns auf die mitochondriale Veränderungen während der visuellen CML. Mitochondrienmembranpotential Verlustleistung ist eine frühe und irreversible Schritt bei der mitochondrialen funktionalen Änderungen zur Apoptose führen 8. Mit der konfokalen Mikroskopie lebender Zellen, konnten wir Beta-Zell-Mitochondrienmembranpotential Verlustleistung bei Interaktionen mit autoreaktiven T-Lymphozyten zu visualisieren. Diese experimentelle Einstellung imitiert zumindest einen Teil von dem, was passiert mit Beta-Zellen während der Entwicklung von T1D. Einschränkungen dieses Experiments sind: der Heizeinsatz für Live Cell Imaging mit unseren Zeiss-Mikroskop ausgerüstet wurde 3,5 cm Petrischalen ausgelegt, daher bei der Verwendung von 8-Well-Lab-Tak II chambered Deckglas (für die gleichzeitige Aufnahme von behandelten und Kontrollen), der Griff auf die Kammern Deckglas muss entfernt werden, um in das Mikroskop legen fit werden. Auch, weil die Heizeinsatz für einen 35mm-Petrischale, ist so konzipiert, wenn wir 8-Well-Lab-Tak II chambered Deckglas zu verwenden, wurden wir in der Mitte 4 Bohrungen begrenzt. Diese Einschränkung kann durch Einbau eines Heizeinsatz speziell für Lab-Tak II chambered Deckglas von Zeiss entwickelt gelöst werden. Mögliche Änderungen dieses Experiments einschließlich der Verwendung von gentechnisch fluoreszierenden Effektor-T-Zellen zu Zielzellen angreifen, oder testen Signalwege von Zytokinen oder Zell-Zell-Interaktionen. Beta Zelltod in der Pathogenese des T1D ist ein komplizierter Prozess, umfasst mehrere Wege, einschließlich aber nicht beschränkt auf Granzyme und Perforin 9, Fas / Fas-Ligand 9, Zytokine 10 begrenzt. Es gibt fluoreszierende Substrate für Caspasen und Granzym B im Handel erhältlich; mit diesen Entscheidungen ist es möglich, Wege und die Abfolge der Ereignisse während der Beta-Zell-Tod zu studieren.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Florida Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK074656 und AI56374 (CEM), sowie die Juvenile Diabetes Research Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
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