Summary
細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。
Abstract
1型糖尿病（T1D）は、T細胞媒介性自己免疫疾患である。インスリン産生が失われると病因の間に、患者は、T細胞による膵β細胞の破壊から、おそらくこの結果は、次第にinsulinopenicになる。 T1Dの開発中にベータ細胞死のメカニズムを理解することはこの病気のための効果的な治療法を生成するための洞察を提供します。細胞媒介lymphocytotoxicity（CML）アッセイは、歴史的に標的細胞を標識する放射性核種クロム51（51 Cr）を使用している。これらのターゲットは、エフェクター細胞に曝露されており、標的細胞からの51 Crの放出は、リンパ球が介在する細胞死の指標として読み込まれます。 51 Crの減少のリリースでは細胞死の結果の阻害剤。
エフェクター細胞として、我々はAI4 T細胞受容体（TCR）のαとβ鎖の両方のためのマウスの株式のトランスジェニックから分離されたCD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化自己反応性クローン集団を使用する。活性化さAI4 T細胞が16時間の51 Cr標識標的NITの細胞と共培養された、51 Crの放出は、特異的溶解を計算するために記録された
ミトコンドリアなどのエネルギー生産、伝達をシグナル伝達の調節、およびアポトーシスなどの多くの重要な生理学的なイベントに参加。 T1Dの開発中のベータ細胞のミトコンドリアの機能変化の研究は、研究の新たな領域です。ミトコンドリア膜電位色素テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを使用して、我々は、β細胞株NIT - 1で時間をかけてミトコンドリア膜電位をモニターする。イメージング研究のために、エフェクターAI4 T細胞は、蛍光核染色色素Picogreenで標識した。 NIT - 1細胞とT細胞はチャンバーカバーガラスで共培養し、生細胞のチャンバーを装備した顕微鏡ステージに搭載された、37℃に制御された° C、5％CO 2、及び加湿付き。これらの実験中にイメージは、各クラスタから400分毎に3分を採取した。
400分のコースで、我々はAI4 T細胞が接続されていたNIT - 1細胞クラスターのミトコンドリア膜電位の散逸を観察した。 NIT - 1細胞はMHCの不整合ヒトリンパ球Jurkat細胞と共培養した同時対照実験では、ミトコンドリアの膜電位はそのまま残った。この手法は、細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、または他の細胞毒性試薬の攻撃を受けて細胞内のミトコンドリア膜電位のリアルタイムの変化を観察するために使用することができます。
Protocol
1。細胞の調製
- 標的細胞培養：マウスのβ細胞株、NIT - 1及びNIT - 4の培養は、10％FBS、0.02％BSA、非必須アミノ酸、15mmのHEPES、16.5を含むDMEMで前に説明した1,2だったGlocoseおよびペニシリン/ストレプトマイシン。 5 × 10 4細胞で平底96穴培養プレートの51 Crのラベル、種子の細胞/ウェル200μlの培養培地中のため。顕微鏡実験、500μlの培養培地中のチャンバーあたり5 × 4で8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラスの種子の細胞、および細胞毒性実験に使用する前に48時間のために成長することができます。
- 制御性T細胞株の培養：陰性コントロールとしてJurkat細胞細胞株（ATCC、CD3 +ヒトリンパ球細胞株）を使用してください。 RPMI1640で培養したJurkat細胞は10％FBS、2mMのL -グルタミン、1.5 g / Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウムを補充した。
2。エフェクター自己反応性CD8 + T細胞の収集と活性化
NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJは[NOD - AI4a]とNOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入し、私たちのマウスの施設で飼育。とNOD - AI4aの交配からのF1雑種子孫NOD - AI4b [NOD - AI4a / b]の年齢の3〜5週間で糖尿病を発症する。すべてのマウスは、特定病原体フリーの施設に収容され、関連する機関の動物実験委員会によって承認された。
- CO 2を使用して3から4週齢のNOD - AI4a / Bマウスを安楽死させる。
- マウスから脾臓を収集する。安楽死させたマウスは、エタノールを噴霧して準備し、手術のフードの下で開かれます。脾臓を除去し、直ちに氷冷したHBSSバッファに置かれます。
- 7 mLのガラスホモジナイザーを用いて脾細胞を収集する。 2〜3脾臓それぞれは冷たいHBSS 5mLに入れ、7 mLのガラスホモジナイザーでホモジナイズされています。ホモジネートを4℃で5分間、1200rpmで収集し、遠心分離され° CソーバルRT7 +遠心分離機を使用して。細胞ペレットが収集されます。
- 低張液処理を用いて赤血球を削除します。ペレットを、HBSSの等量を加えて中和、5分間氷上で5 mLの低張液/脾臓で処理されています。上記のように、遠心分離によって細胞を回収し、50mlのHBSSに再懸濁します。セルストレイナーを通して浮遊細胞を渡すとTrypanBlue染色と血球計数器を用いてカウント。
- 細胞を活性化させる。 RPMI1640で0.1μMAI4 mimotope（アミノ酸配列のYFIENYLEL）および25 U / mLのIL - 2で3日間培養を用いて5 × 10 6 / mLおよび活性化における再懸濁し、細胞は10％FBSを補充し、2mM L -グルタミン、1.5グラム/ Lの重炭酸ナトリウム、10mMのHEPESおよび1.0mMのピルビン酸ナトリウム。
（3）51 Cr放出アッセイは、CMLを検討する
- ラベルの標的細胞：3時間1μCi/ウェルと文化で細胞を標的とし、培養液で3回洗浄するための51 Crを追加する。
- ステップ2.5で述べたように、それぞれに追加された最後のボリュームが十分に200μlになるようにRPMI1640培地にエフェクター細胞を一時停止する。
- 比率：標識した標的細胞の最終洗浄後、ターゲット（T E）にエフェクター希望で、標的細胞の培養に活性化エフェクター細胞を加える。 0.4:1、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1と50:1でT比：我々は、通常のEを使用してください。
- 自発的な溶解のコントロールとして動作するように標的細胞の6ウェルに新しい改変RPMI 1640培地を（ステップ2.5参照）を追加します。
- 16時間共培養エフェクターと標的細胞。
- 6x50 mm黄ガラスチューブに上清を収集する
- 100μlの2％SDSを添加すると軽く数回ピペッティングして細胞を溶解する。
- 6x50 mm黄ガラス管の別のセットで細胞ライセートを収集する。
- クリーンなH 2 Oで一回井戸を洗浄し、細胞溶解液のチューブに洗浄液を加える。
- ガンマカウンターを用いて上清および細胞溶解物を数える。
- 次のように特異的溶解を計算します。
4。生細胞イメージングのための細胞の染色
最も一般的に使用されるミトコンドリア膜電位の染料の中で、TMRMが少なくともミトコンドリア毒性を示す。従って3、我々はこれらの生細胞イメージング研究のためのTMRMを選択してください。
- -20℃でDMSOと店舗では40 mMストックTMRMの溶液を調製[25 nMの] NIT - 1細胞培養1のすべてのサプリメントとフェノールレッドを含まないDMEMで新鮮な実用的なソリューションを行います。
- 37℃で30分間TMRM 25nMの持つターゲットNIT - 1細胞を染色℃に
- 染料4の平衡分布を維持するために5nmのTMRMを含む新鮮な培地を使用してメディアを交換してください。
- 血球計数器を用いて活性化エフェクターAI4 T細胞を数える。
- 1μL/ mLのPicogreen用で活性化したエフェクターAI4 T細胞を染色フェノールレッドを含まない培地で室温と洗浄で5分間3回。
5。生細胞イメージングを用いて評価するTリンパ球が介在するβ細胞死
- ツァイスLSM 510共焦点顕微鏡のステージ上で染色されたNITの細胞をチャンバーカバーガラスをマウントします。 etheline酸化物とチャンバーのガラスを殺菌dremmelとガスでタブを削除します。ステージは、37の温度を制御している生細胞イメージングチャンバー℃、5％の水分とCO 2が装備されています。
- アクティブに追加し、別のEで指定されたチャンバーに染色したT細胞：T比。
- 制御室に染色したJurkat細胞の同じ数を追加しました。
6。生細胞の画像を取得
顕微鏡は、私たちは繰り返し実験の時間の経過とともに自動的に同じまたは別のチャンバーから別の場所で画像を取得するために許可されて電動ステージを装備しています。
- 63x油浸対物レンズを使用して、場所ごとに300フレームの合計で3分ごとの間隔で画像を撮影する。
- 発光565〜619 nmの励起波長543 nmの長さとフィルターのセットを使用してTMRM染色を検出
- 励起波長488nmおよび発光500〜630 nmのフィルターセットを使用してPicogreen染色を検出する。ビデオは、ツァイスLSMソフトウェアを使用して作成されました。
7。出版物のためのビデオ変換
- ツァイスLSMソフトウェアを使用して、AVI形式で圧縮されていないムービーファイルを作成します。
- 公開されたフォーマットにビデオを変換するには、ソフトウェアパッケージフィジー（にビデオをインポートhttp://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ）、ImageJを（ http://rsb.info。 nih.gov / IJ /遺伝子座（からBioformatsプラグインを使用して）配布、 http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ）。
- 緑と赤の信号のバランスをとるために明るさとコントラストの設定を調整し、フレームレートは、アニメーションのオプションメニューを使用して、2フレーム/秒に設定されていました。
- 非圧縮のAVIファイルとして512 × 512ピクセル、輸出するビデオをトリミング。
- ソフトウェアのQuickTime 7（アップルコンピュータ、カリフォルニア州クパチーノ）は、このAVIファイルを開き、1200 KBS /秒で圧縮して、開いているビデオファイル形式H264/MPEG-4でエクスポートする。
8。代表的な結果：
- の51 Cr CMLアッセイの代表的な結果。ターゲットの比（X軸）の増加：図1は、パーセント特異的溶解（Y軸）がエフェクターとして増加CMLアッセイの代表的な結果を示しています。標的細胞は、免疫不全NODから分離された主要な島ですRAG1 - / -マウスと51 Crで標識した。上記のステップ2で説明したようにNOD.AI4α/βトランスジェニックマウスから脾細胞を単離し、活性化される。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。上記のステップ3.11に説明するようにパーセント特異的溶解が計算されます。
- T細胞媒介性のβ細胞のミトコンドリア膜電位損失の二つの代表者（正および負）の結果が表示されます。細胞が染色されたものであり、手順4、5、6で説明したように反応が記録され、ビデオファイルは、手順7のように作成されます。ビデオ1：マウスのβ細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化、自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1 400分の持続時間の間、だけAI4 T細胞と相互作用されたクラスタで徐々に消費されるミトコンドリア膜電位。ビデオ2：50:1のT比：対照実験として、NIT - 1細胞をTMRMとEでPicogreenステンドJurkat細胞と共培養して染色した。 Jurkat細胞は、一致しないMHCであるヒトT細胞株です。 NIT - 1細胞は、400分の共同潜伏期間の全期間を通じてミトコンドリアの膜電位を維持した。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用しておらず、したがって、殺す誘導しない。
NOD.AI4α/βトランスジェニックマウスからのマウスおよび脾細胞- 。標的細胞免疫不全NOD.Rag1 - /から分離された主要な島として使用してCMLの図1代表的な結果。ターゲットとエフェクターを16時間共培養した。エフェクターとしてパーセント特異的溶解が増加：ターゲットの比率が増加する。
ビデオ1。マウスのβ細胞株NIT - 1はミトコンドリアの膜電位色素TMRM（赤）を染色した。 50:1のT比：活性化自己反応性CD8 + T細胞AI4（Picogreenで染色緑）は、これらのNIT - 1 Eで細胞と共培養した。 NIT - 1のミトコンドリア膜電位のdissipa徐々に400分の期間中、しかし唯一の緑AI4 T細胞と相互作用していたクラスタのテッドは。 ビデオを見るにはここをクリック 。
ビデオ1とPicogreen染色したヒトT細胞株Jurkatと共培養で説明したようにビデオを2。NIT - 1細胞は同じ染色した。 NIT - 1細胞は、ミトコンドリア膜電位400分の持続時間を考えを維持することができた。 Jurkat細胞は、NIT - 1のクラスターと相互作用していないため、殺害を誘発しない。 ビデオを見るためにここをクリック 。
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Discussion
細胞傷害性T細胞を介したβ細胞死は、T1D 5の主な病態である。 51 Cr放出を用いたCMLアッセイは、私たちはエフェクター-ターゲットの反応6の度合いを調べることができます。しかし、詳細なプロセスと、T細胞媒介性のβ細胞死の経路はまだ完全には理解されていない。ミトコンドリアは、β細胞機能と死7の重要なので、我々は、視覚的なCMLの間にミトコンドリアの変化に焦点を当てた。ミトコンドリア膜電位の散逸は、アポトーシス8につながるミトコンドリアの機能変化の早期にかつ不可逆的なステップです。共焦点顕微鏡のライブセルイメージングを使用して、我々は、自己反応性Tリンパ球との相互作用中にβ細胞のミトコンドリア膜電位の散逸を可視化することができた。この実験的な設定は、T1Dの開発中のベータ細胞に何が起こるかの少なくとも一部を模倣しています。この実験のような制限があります：8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラス（同時に治療の記録とコントロール用）、ハンドルを使用する際にツァイスの顕微鏡を装備した生細胞イメージングのための加熱インサートしたがって、3.5センチメートルペトリ皿用に設計されてチャンバーカバーガラス、顕微鏡のインサートに適合するために削除する必要があります。また、加熱インサートは35mmペトリ皿用に設計されているので、我々は8ウェルのLab -徳IIチャンバーカバーガラスを使用するとき、我々は中央4ウェルに限られていた。この制限は容易に特にツァイスでのLab -徳IIチャンバーカバーガラスのために設計された加熱インサートのインストールで解決することができます。標的細胞を攻撃するために遺伝的に蛍光エフェクターT細胞を使用して、またはサイトカインや細胞間相互作用のシグナル伝達経路のテストを含め、この実験の可能性の修正。 T1Dの病因におけるβ細胞死は、複雑なプロセスであるなど、複数の経路を伴いますが、グランザイムとパーフォリン9、Fas抗体/ Fasリガンド9、サイトカインが10に限定されない。カスパーゼと市販のグランザイムBのための蛍光基質がありますが、これらの選択肢を持つことは、経路とβ細胞死の間のイベントのシーケンスを学習することが可能です。
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Disclosures
動物実験は、フロリダ大学の動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
この作品は、健康DK074656とAI56374（CEM）の国立研究所からの補助金だけでなく、若年性糖尿病研究財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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