Summary
שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.
Abstract
תאים בכבד Kupffer הם ספציפיים מקרופאגים תושב לשחק תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של הכבד 1-3. למרות שיטות הבידוד של מקרופאגים הכבד כבר היטב תיאר 4-6, רוב השיטות האלה דורשות ציוד מתוחכם, כגון elutriator צנטריפוגלי וכישורים טכניים. כאן, אנו מספקים שיטה חדשה להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספיק מתרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר, כפי שמודגם סכמטי באיור 1.
לאחר ניתוק של תאים בכבד על ידי שני שלבים 7,8 שיטה זלוף, שבר מורכב ברובו hepatocytes parenchymal ערוכה seeded לתוך T75 תרבות צלוחיות עם רקמה בינוני תרבות מורכבת DMEM hepatocytes FCS.Parenchymal ו 10% לאבד את המורפולוגיה תא אפיתל בתוך ימים ספורים בתרבות, מנוונת או להפוך תאים דמויי פיברובלסטים (איור 2). כמו תרבות התמורה, סביב יום 6, שלב בניגוד בהיר, עגול macrophage כמו התאים מתחילים להתרבות בגיליון תא fibroblastic (איור 2). הצמיחה של macrophage דמויי תאים להמשיך ולהגיע לרמות היותר סביב 12 יום, המכסים את הגיליון התא על פני הבקבוק. על ידי רועדת של צלוחיות תרבות, מקרופאגים מושעים בקלות לתוך המדיום לתרבות. לאחר העברת ו דגירה קצרה בעקבות הידבקות צלחות פלסטיק סלקטיבית של מקרופאגים (איור 3), שם כמו תאים מזהמים אחרים נשארים תלויים. אחרי כמה שטיפות עם PBS, מקרופאגים מצורף נקצרים. יותר מ 10 6 תאים ניתן לקצור שוב ושוב במשך יותר משבועיים (איור 3) מן הבקבוק רקמות זהה T75 התרבות בשעה 02:58 במרווחים יום. Purities של מקרופאגים מבודד היו 95-99%, כפי מוערך על ידי cytometry זרימה או immunocytochemistry עם macrophage נוגדנים ספציפיים חולדה (איור 4). בתאים מבודדים להראות phagocytosis פעיל של חרוזים polystylene (איור 5), בתגובה על שגשוג רקומביננטי GM-CSF, הפרשת דלקתי / אנטי דלקתיות ציטוקינים על גירוי עם LPS, היווצרות של תאים ענק multinucleated 9.
לסיכום, אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספקת וללא ציוד skills.This מורכבות השיטה עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.
Protocol
1. זלוף הכבד
- הרדימי עכברוש מבוגר זכר Sprague-Dawley (ב -10 ל -15 שבועות בת: משקל גוף 150-200 גר ') על ידי זריקה intraperitoneal של פתרון נתרן pentobarbital (50 מ"ג נתרן pentobarbital / ק"ג משקל גוף).
- מניחים את החיה במחבת נירוסטה תרסיס אתנול 70% על הבטן שלה החזה.
- ביצוע חתך קטן לקלף את העור. פתח את הבטן על ידי לחתוך עם מספריים.
- אשר את מיקומו של וריד שער, להעביר חוט כירורגי תחת הווריד הפורטל רופף גוש.
- גוש החלק הדיסטלי של קאווה הנבוב נחות וריד mesenteric למנוע ריפלוקס הדם אל הכבד. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת במספריים, ולחשוף את הלב.
- הכנס קטטר פלסטיק (2 מ"מ קוטר) לווריד פורטל להדק את החוט בחוזקה סביב הקטטר.
- חבר את הקטטר למערכת זלוף אשר נטען עם פתרון כביסה (Ca 2 +-Mg 2 + HBSS חינם המכיל 0.5 mM EGTA, HEPES 10 מ"מ ו 4.2 mM NaHCO 3; pH 7.2) prewarmed על 37 ° C.
- בגין זלוף באתרו בשיעור של 10 מ"ל / דקה. באותו הזמן, לעשות חתך בדופן ימין אטריום. המשך זלוף במשך 10 דקות.
- החלף את הפתרון זלוף לפתרון collagenase [HBSS המכיל HEPES 10mm ו 4.2mM NaHCO 3 בתוספת סוג אני collagenase (0.05%) ו מעכבי טריפסין (50 מיקרוגרם / מ"ל); pH 7.5], ו perfuse עבור 10 - 20 דקות בקצב של 10 מ"ל / דקה עד הכבד מתנפח מעט ומראה את סימן להתפוררות של המבנה הכבד תחת קרום הצפק.
2. הכנת שבר hepatocyte עשיר Parenchymal Cell
- הסר בזהירות להעביר את הכבד לתוך מבחנה סטרילית המכילה 25 מ"ל של תמיסת collagenase. לקצץ לחתיכות קטנות על ידי מספריים.
- הוסף 75 מ"ל של ממ קר לתוך התא כתוצאה ההשעיה. לאחר pipetting עדין, תסנין דרך מסננת תא (100 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות החיבור ושברי רקמות מעוכל.
- מעבירים את תסנין לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות XG ב 50 דקות 1 ב 4 ° C (בלם כבוי).
- בזהירות להתעלמות supernatant. Resuspend גלולה עם מזכרות קר.
- חזור 2.4) שלוש פעמים.
3. תרבות ראשי מעורבות של תאים בכבד
- להשעות את התאים המתקבלים 2.5) במדיום הגידול מורכב המכיל DMEM חום FCS 10% מומת, בתוספת 100 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין, וזרעי לתוך 09:55 בתרבית רקמה צלוחיות (שטח: 75 ס"מ 2) בצפיפות של 6.7 x 10 4 תאים / ס"מ 2 (5 x 10 6 תאים / בקבוק / 12 -15 מ"ל של מדיום).
- דגירה התרבות flasksat 37 ° C באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%.
- החלף את מדיום הגידול כל 2-3 ימים במרווחים.
4. בידוד סלקטיבי של המקרופאגים
- לאחר 12 ימים של תרבות, מקרופאגים להתרבות בגיליון התא. תאים אלה מושעים ידי הגומלין רועד של צלוחיות תרבות ב 80-120 משיכות לדקה למשך 30 דקות ב 37 ° C.
- העברת בינוני תרבות לתוך 100 מ"מ רקמת שאינם מאכלים תרבות כיתה פלסטיק. בריכת בינוני משני T75 לתוך צלוחיות מנה אחת מפלסטיק. צלוחיות עם מילוי תרבות המדיום הצמיחה ולהחזיר אותם בחממה.
- דגירה מנות פלסטיק למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%. המקרופאגים ברצון לצרף רקמות שאינן כיתה תרבות צלחות פלסטיק תחת תהליך הדגירה, בעוד התאים מזהמים אחרים לא.
- לשאוב הבינוני בעדינות ולשטוף את צלחת פלסטיק עם PBS. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת אקספרס TrypLE לתוך התבשיל, ואת דגירה עבור 10min ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%.
- הוסף 9 מ"ל של מדיום הגידול. בעדינות לגרד את מקרופאגים שצירפו מגרד תא.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ו - 180 צנטריפוגות ב XG 5 דקות במהירות של 25 ° C (על הבלמים).
- בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting נמרצת. ספירת מספר התאים על ידי ספירת-hemocytometer.
- צעדים בידוד ניתן לחזור עם צלוחיות תרבות באותו 02:58 במרווחים יום במשך יותר משבועיים.
- מקרופאגים מבודד יכול להיות מתורבת במדיום הגידול המתואר 3.1.
5. נציג תוצאות
דוגמה לתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד המבוגר עכברוש מוצג באיור 2. Hepatocytes Parenchymal לאבד את המורפולוגיה תא אפיתל בתוך ימים ספורים בתרבות, מנוונת או להפוך פיברובלסטים דמויי תאים.ואז, בסביבות יום 6 עד 12, לעומת זאת בשלב בהיר, עגול macrophage דמויי תאים vigourouly להתרבות בגיליון תא fibroblastic. על ידי רועדת של צלוחיות תרבות, מקרופאגים מושעים בקלות לתוך המדיום תרבות, ולהעביר הדגירה עתידיים בצלחות פלסטיק לגרום הדבקה סלקטיבית של מקרופאגים (איור 3). Macrophage כמו התאים ניתן לקצור כבר ביום 8, וכן את המספרים הגיעו לרמות מירבית בימים 12-14. יותר מ 10 6 תאים ניתן לקצור מבקבוקון T75 תרבות שוב ושוב במשך יותר משבועיים בבית 2-3 במרווחים יום, המאפשר תשואה התא הכולל לכל בקבוק של בקבוק 10 7 לכל תרבות T75 (איור 3). Purities של מקרופאגים מבודד היו 95-99%, הערכה לפי flowcytometry או immunocytochemistry עם macrophage נוגדנים ספציפיים חולדה, כגון ED-1 (איור 4), ED-3, OX-41 (איור 4) ו Iba1 9. תאים מבודדים להראות מאפיינים טיפוסיים של מקרופאגים, כגון phagocytosis פעיל של חרוזים polystylene (איור 5), בתגובה על שגשוג רקומביננטי GM-CSF, הפרשת דלקתי / אנטי דלקתיות ציטוקינים על גירוי עם LPS, היווצרות של תאים ענק multinucleated 9.
באיור 1. תכנית לבידוד לטיהור סלקטיבית של macrophage דמויי תאים מתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה.
איור 2. לתרבות ראשונית של תאים בכבד חולדה הפצת macrophage דמויי תאים. החץ מצביע על התא ענק multinuclear. בר סולם = 100 מיקרומטר. הודפס מתוך כתב העת של שיטות החיסוני, Vol.360, 47-55 (2010) 9 באישור Elsevier.
איור 3. בידוד סלקטיבי של macrophage דמויי תאים על ידי לוחץ את שיטת ההתקשרות. תאים הושעו לתוך המדיום התרבות ידי ניעור צלוחיות, הועבר לאחר מכן לתוך הרקמה הלא מנות התרבות כיתה פלסטיק, מודגרות ב 37 ° C. כבר 10 דקות אחרי ציפוי, macrophage דמויי תאים המחוברים פני השטח את המנה, ואילו השני תאים fibroblastic לזהם נשארה תלויה על בלימה. לאחר שטיפה עם PBS, אוכלוסייה macrophage מטוהרים הושג. תאים אלה זכו מורפולוגיה macrophage טיפוסי לאחר 40 דקות של תרבות, והתאים mitotic נצפו לעתים קרובות (חיצים). השינויים הבאים במספרים תא התאושש צלוחיות בתקופות תרבות שונים מוצגים. הערכים הם ממוצע ± SD 3-5 צלוחיות. ניסויים חזרו שלוש פעמים נתונים מסומנים על ידי סמלים שונים. בר סולם = 100 מיקרומטר. הודפס מתוך כתב העת של שיטות החיסוני, Vol.360, 47-55 (2010) 9 באישור Elsevier.
איור 4. מכתים Immunocytochemical של macrophage דמויי תאים עם נוגדנים חד שבטיים נגד מקרופאגים חולדה.
איור 5. Phagocytosis של FITC שכותרתו microbeads ידי macrophage דמויי תאים.
Discussion
כאן אנו מדווחים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים מן התרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר. השיטה שלנו מתבססת הראשון על פעילות שגשוג הרומן של מקרופאגים בתרבות מעורבת של תאים בכבד חולדה, ואחר כך בידוד וטיהור עתידיים של תאים אלה על בסיס המאפיינים הביולוגיים שלהם, כמו מקרופאגים 9. אפשר אולי מקרופאגים התרבו בתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד מבוגר שאולי מקורם Kupffer או תאים הקשורים זה מזוהמים לתוך השבר hepatocytes parenchymal. מקרופאגים אולי הגיב לשינויים סביבתיים ספציפיים שנגרמו על ידי הפיכתו של hepatocyte תאים parenchymal fibroblastic 10 אחרים בתרבויות העיקרי מעורבת.
לסיכום, השיטה שלנו מספק בידוד של macrophage דמויי תאים במספר טוהר מספיק מן התרבות העיקרי של הכבד עכברוש cellswithout באמצעות ציוד מתוחכם מיומנויות טכניות. בנוסף, הליך הבידוד ניתן לחזור עם בקבוק התרבות אותו במשך יותר משבועיים. שיטה זו עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.
Disclosures
כל בעלי החיים הוחזקו ומופעל במתקן בעלי חיים המכון הלאומי לבריאות בעלי חיים, על פי הנחיות ותקנות שנקבעו על ידי הוועדה של מכון לניסויים בבעלי חיים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר גרנט-in-Aid מפרויקט ננוטכנולוגיה מזון של משרד החקלאות, יערנות, דיג ו של יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell, Liver fibrosis: the hepatocyte revisited. Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).
