Summary
इस वीडियो formalin-तय आयल एम्बेडेड सामग्री से डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल को दर्शाता है. यह एक बहु दिन की प्रक्रिया में जो ऊतक वर्गों xylene के साथ deparaffinized कर रहे हैं, इथेनॉल के साथ rehydrated और proteinase कश्मीर के साथ इलाज के लिए शुद्ध और बाद जीन - विशिष्ट या जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए डीएनए को अलग है.
Protocol
Discussion
Histopathologic विश्लेषण और निदान के लिए biopsied या शल्य चिकित्सा excised ऊतकों अक्सर लंबी अवधि के भंडारण के लिए formalin निश्चित और आयल एम्बेडेड (FFPE) कर रहे हैं. रोग के आनुवंशिक आधार को समझने में बढ़ती रुचि के साथ, इन नमूनों से डीएनए निकालने की क्षमता नैदानिक सामग्री है कि जीनोमिक विश्लेषण और translational अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अमूल्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. ऐतिहासिक रूप FFPE नमूने आणविक विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य स्रोत नहीं माना गया न्यूक्लिक एसिड के रूप में भारी प्रोटीन nucleic एसिड और प्रोटीन, प्रोटीन के पार 6 जोड़ने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. हालांकि, इन मूल्यवान नमूनों की खोज की है कि protease पाचन खंडित न्यूक्लिक एसिड होता है जो पीसीआर, सरणी CGH, अनुक्रमण और मेथिलिकरण रूपरेखा सहित बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं विज्ञप्ति, आनुवंशिक 6 विश्लेषण के लिए उपयोग सक्षम बनाता है.
आयल - एम्बेडेड ऊतकों से डीएनए निष्कर्षण एक मजबूत प्रक्रिया है कि अंतर करने के लिए डीएनए शुद्ध विलेयता पर निर्भर करता है है. निकाले डीएनए गुणवत्ता और मात्रा और बाद में डीएनए प्रवर्धन की सफलता के दौरान और बाद निष्कर्षण पहले मानकों की एक संख्या पर निर्भर है. ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं: प्रकार और ऊतकों की राशि, ऊतक संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया लगानेवाला के प्रकार निर्धारण की अवधि, आयल ब्लॉक और भंडारण की स्थिति की उम्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वांछित डीएनए खंड की लंबाई 1,7 प्रवर्धित. ऊतक से आयल का हटाया सफल निकासी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है undissolved आयल के रूप में गरीब नमूना गुणवत्ता और पीसीआर प्रवर्धन के निषेध की ओर जाता है है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम अपने मूल्यांकन और इस वीडियो और लेख के critiques के लिए लैम प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा के लिए से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | VWR international | CABDH6216- 4 | - |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | - |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet International | C0160-B | - |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
||
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher Scientific | BP1750I-400 | - |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher Scientific | BP1752I-400 | - |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
||
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | - | - |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
